Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中表达及其相关性研究

李伟，李双霞，孟元华，李凤玉，张奇芳，黄勇，牛晓东，朱利利

(1.陆军第八十一集团军医院 a.病理科，b.检验科，c.肿瘤科，d.麻醉科，河北 张家口 075000； 2.张家口市第一人民医院超声科，河北 张家口 075000； 3.解放军总医院第七医学中心妇科，北京 100700)

乳腺恶性叶状肿瘤是源自小叶内或导管周围间质的恶性改变，发生率虽然低于乳腺癌，但却是乳腺恶性间叶性肿瘤中最常见的肿瘤。目前，乳腺恶性叶状肿瘤的具体病因尚不明确，有资料显示其发病不仅与种族、年龄以及地域等因素有关，可能还与生育哺乳、内分泌变化及多基因变异等有关[1-2]。Piwil2(P-element-induced wimpy testis like 2)蛋白正常仅表达于胚胎干细胞和生殖干细胞，在各种肿瘤组织和肿瘤细胞系也可见Piwil2的表达，其已被认为是肿瘤干细胞的分子标志物[3]，与肿瘤的发生、发展紧密相关。细胞增生离不开细胞周期的调控，而细胞周期调控的失衡或紊乱则会引起细胞的异常增生甚至瘤变。目前，细胞周期蛋白D1(CyclinD1蛋白)被认为是调控细胞周期的重要蛋白之一，其主要功能是调控细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖[4]，而其持续异常表达常与细胞的异常增殖及肿瘤形成有关[5]。查阅资料未发现有关于Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白与乳腺恶性叶状肿瘤相关的报道。鉴于此，本研究主要探讨Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达及其与临床病理因素之间的关系，并分析两种蛋白之间的相关性，为阐述乳腺恶性叶状肿瘤发生机制提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集1990年1月至2015年2月在陆军第八十一集团军医院病理科和解放军总医院第七医学中心病理科存档的60例女性乳腺恶性叶状肿瘤患者的资料，纳入标准：①均为手术标本，且病理诊断明确；②均为首次治疗，未进行过放化疗等；③均未发生淋巴结转移。排除标准：①非首次手术患者(复发)；②病理诊断不明确者。患者年龄32～76岁，平均(52±4)岁；肿瘤直径7～15 cm，平均(9±1) cm；Ki-67≥25%者49例，<25%者11例；瘤细胞异型性显著者48例，不显著者12例；术后复发10例，无复发50例；核分裂象≥15个/10个高倍镜视野者29例，<15个/10个高倍镜视野者31例；所有患者均未发生淋巴结转移，均为首次接受根治性手术治疗。同期选取60例正常乳腺组织为对照组，患者年龄25～38岁，平均(30±2)岁。两组研究对象年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经陆军第八十一集团军医院和解放军总医院第七医学中心医学伦理委员会批准。

1.2主要试剂和方法 浓缩型鼠抗人单克隆抗体Piwil2购自武汉博士德生物技术有限公司，按1∶200稀释浓度滴加标本；即用型兔抗人单克隆抗体CyclinD1蛋白购自福州迈新生物技术有限公司；采用罗氏全自动免疫组化机(美国)及配套试剂进行染色操作。具体操作步骤如下：石蜡防脱片切片(4 μm)，组织漂烘仪(湖北孝感阔海医疗科技有限公司)65 ℃烤片1 h，雀巢全脂牛奶浸泡15 min，放入罗氏全自动免疫组化机，99 ℃修复1 h，再将预先配置好的Piwil2(1∶200)、CyclinD1 一抗滴入标本，30 min，加标记过的二抗，9 min，显色 8 min，洗洁精洗片，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。采用朗珈图像分析系统分析(Ver1.0)，奥林巴斯BX53显微镜(奥林巴斯公司，日本)下观察和分析免疫组织化学(En VisionTM)染色结果。

1.3结果判断 Piwil2蛋白表达结果判断标准[6]：每张切片随机观察10个高倍镜视野，并依据以下标准评分。①胞膜和胞质染色呈棕黄色或棕褐色，按基本不着色、着色淡、着色适中、着色深分别为记为0、1、2、3分；②染色细胞百分率评分按着色细胞计数≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、≥51%为3分；③上述两项得分相乘为其最后得分，即：0～1分为阴性，≥2分为阳性。CyclinD1蛋白表达结果判断：胞核染色为棕黄色或褐色为阳性表达，阳性细胞≥10%为阳性，无染色细胞或阳性细胞<10%为阴性[7]。

1.4观察指标 ①Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织及正常乳腺组织中的阳性表达情况；②Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白的阳性表达与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理因素的关系；③乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2蛋白的表达与CyclinD1蛋白表达的相关性。

1.5统计学方法 采用SPPS 20.0统计学软件进行数据处理，计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织和正常乳腺组织中的表达情况 染色结果显示，Piwil2蛋白着色于细胞质。在60例乳腺恶性叶状肿瘤组织中有53例Piwil2蛋白呈阳性表达，阳性率为88.33%；在正常乳腺组织中不表达Piwil2蛋白，见图1。CyclinD1蛋白着色于细胞核。在60例乳腺恶性叶状肿瘤组织中46例CyclinD1蛋白阳性表达，阳性率为76.67%；在正常乳腺组织中不表达CyclinD1蛋白，见图2。

2.2Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白表达与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理因素的关系 肿瘤直径≥9 cm、Ki-67≥25%、瘤细胞异型显著以及核分裂象≥15个/10个高倍镜视野的患者Piwil2蛋白的表达水平高于肿瘤直径<9 cm、Ki-67<25%、瘤细胞异型不显著以及核分裂象<15个/10个高倍镜视野者(P<0.05)，不同年龄、术后是否复发患者的Piwil2蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ki-67≥25%、瘤细胞异型性显著及核分裂象≥15个/10个高倍镜视野者CyclinD1蛋白的表达水平高于Ki-67<25%、瘤细胞异型不显著以及核分裂象<15个/10个高倍镜视野者(P<0.05)，不同年龄、肿瘤直径及术后是否复发患者的CyclinD1蛋白表达水平比较差异无统学意义(P>0.05)。见表1。

2.3乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2蛋白的表达与CyclinD1蛋白的表达的相关性 经Spearman分析显示，在乳腺恶性叶状肿瘤组织中，Piwil2蛋白的表达与CyclinD1蛋白的表达呈正相关(r= 0.413，P<0.01)。

3 讨 论

乳腺恶性叶状肿瘤是由良性的上皮成分和恶性的间质成分构成，其诊断标准包括细胞浸润性生长，细胞密集增生、异型性，核分裂象≥10个/10个高倍镜视野，可有坏死或出血[8]。目前，部分学者认为乳腺恶性叶状肿瘤来自原始间叶细胞，但也有学者认为是成纤维细胞和肌成纤维细胞[9]。乳腺恶性叶状肿瘤的组织病理学通常表现为纤维肉瘤改变，但也可有异源性分化，如脂肪肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤等，提示瘤细胞具有肿瘤干细胞多向分化的潜能。

1a:乳腺恶性叶状肿瘤组织，阳性表达；1b：正常乳腺组织，阴性表达

2a:乳腺恶性叶状肿瘤组织，阳性表达；2b：正常乳腺组织，阴性表达

表1 Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白阳性表达与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理因素的关系 [例(%)]

Piwil蛋白在多种细胞进程中起重要作用，如干细胞自我更新、RNA沉默、精子发生、翻译调节、染色质重塑等。到目前为止，人类Piwil家族中4个成员已被识别，分别为Piwil1、Piwil2、Piwil3、Piwil4[10]，其中Piwil2仅表达于正常人体的睾丸和造血干细胞[11]。何朝辉等[6]研究发现，膀胱尿路上皮癌组织中Piwil2蛋白的表达明显高于正常组织，与临床分期相关，并影响膀胱尿路上皮癌的生物学行为，且有可能成为高风险膀胱癌患者的预后指标[12]。也有研究显示，Piwil2蛋白参与了乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多种肿瘤的形成、发展[13-15]，其通过激活内源性RNA干扰，活化信号转导及转录激活因子3/Bcl-XL和信号转导及转录激活因子3/CyclinD1蛋白两个重要的细胞信号通路，调控细胞周期，抑制细胞凋亡及诱导扩增[16]。

瘤细胞的分裂、增殖离不开细胞周期的调控，作为G1期细胞增殖信号的关键蛋白——CyclinD1蛋白，通过与周期素依赖蛋白激酶4/6形成复合物，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白，然后后者释放转录因子E2Fs，从而缩短由G1期进入S期的时间，参与细胞周期的调节、促进细胞增殖[17]。如果CyclinD1蛋白过表达，细胞增殖异常则会导致细胞失控性增殖，进而引起肿瘤的发生[18]。在胃癌、食管鳞状细胞癌、非小细胞肺癌等[19-21]组织中均发现CyclinD1蛋白的表达高于相应的正常黏膜组织。吴晓明等[22]研究发现，CyclinD1蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性表达显著高于正常组织，且表达与病理学分级有关，分化越低表达越高，但与TNM分期及淋巴结转移无关。本研究结果显示，Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织中呈阳性表达，而在正常乳腺组织无表达，这表明Piwil2蛋白、CyclinD1蛋白在乳腺恶性叶状肿瘤组织存在异常表达，可能参与了乳腺恶性叶状肿瘤的形成。

Ki-67是一种较为肯定的细胞增殖相关核抗原，其功能与细胞有丝分裂、细胞增殖有关，其高表达提示细胞分裂和增殖能力强。权明吉等[23]研究发现，Ki-67在胃癌组织中的阳性表达与Borrmann分型、组织分化、TNM分期及淋巴结转移有关，其表达水平有助于判断胃癌的恶性程度及侵袭和转移能力。在非小细胞肺癌中，Ki-67表达越低，患者的中位生存期越高[23]。本研究结果显示，乳腺恶性叶状肿瘤中Ki-67≥25%、瘤细胞异型显著以及核分裂象≥15个/10个高倍镜视野的患者Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的阳性表达率高，提示Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白阳性表达的瘤细胞可能具有更强的分裂、增殖能力，更有利于瘤细胞的生长及侵袭。乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2蛋白的表达与CyclinD1蛋白的表达呈正相关，提示Piwil2蛋白的表达可能通过激活某种信号通路，进而活化CyclinD1蛋白，共同实现了瘤细胞的增殖。

综上所述，Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白的过表达参与了乳腺恶性叶状肿瘤的形成，其表达水平可作为评判瘤细胞分裂、增殖的参考指标。有研究显示，通过沉默Piwil2的表达后，宫颈癌细胞的增殖和集落形成能力均降低，细胞衰老数量也明显增多[24]。沉默CyclinD1蛋白的表达后，肝癌细胞生长速度减慢，凋亡率上升[25]。推测Piwil2蛋白和CyclinD1蛋白有可能成为乳腺恶性叶状肿瘤靶向治疗的潜在靶点，待今后需进一步深入研究。