前置固相吸附材料对烟熏鲟鱼片的影响及工艺优化

李崇豪 张卓潍 陈 康 戴志远 沈 清

(1 浙江工商大学海洋食品研究院/浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310012；2新昌县鲟鳇鱼生物科技有限公司，浙江 绍兴 312500)

传统的烟熏工艺不仅能提高食品的保质期，而且能赋予食品特殊的烟熏香味[1]，但也会产生苯并芘[benzo(a)pyrene，BaP]等一系列致癌物[2-3]。BaP 是苯与芘稠合而成的一类多环芳烃[4]，主要由高温条件下烟熏材料不完全燃烧或还原性气体环境中热分解产生，其分布广泛、性质稳定、致癌性强，是主要的环境和食品污染物[5]，而常规烟熏工艺制备的即食鱼片中BaP 含量高达24.1 μg·kg-1。BaP 可经过食道、呼吸、皮肤吸收等方式进入人体，并通过血液循环在人体主要器官中沉积，严重威胁消费者的生理和心理健康[6-7]。

目前烟熏过程中BaP 含量的控制主要通过熏烟过滤技术、发烟材料改进、烟熏工艺优化和使用抑制剂等方法。宋忠祥等[8]采用熏烟水雾过滤技术，通过将净化后的烟气喷淋到产品表面，大幅度降低了烟熏过程中BaP 的产生。钟昳茹等[9]以湖南腊肉材料，对比了树枝、锯末、米糠、木粒、杂木5 种发烟材料对烟熏过程中BaP 含量的影响，发现不同烟熏材料产生的BaP含量不同，其中锯末产生的BaP 含量最低。此外，干燥的发烟材料比潮湿状态的发烟材料所产生的BaP含量低[10]。烟熏的温度、时间和方式也会导致BaP 含量的改变，Kazerouni 等[11]对高温与低温条件下烟熏过程中所产生的BaP 含量进行研究，结果表明高温条件下所产生的BaP 含量更高；研究还发现，随着烟熏时间的延长，BaP 会渗入肉制品中[12]。

本试验以鲟鱼片为原料，通过前置固相吸附装置在线筛滤熏烟中BaP 类化合物，比较分子筛、硅胶等固相填料对烟熏鱼片中BaP 和芳香性风味物质的影响，并采用响应面法优化加工工艺，旨在截留熏烟中BaP 类化合物的同时最大保留芳香类化合物，为开发新型安全的烟熏食品提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲟鱼肉，新昌县鲟鳇鱼生物科技有限公司；乙腈(分析纯)、正己烷(分析纯)、氢氧化钾，国药集团化学试剂有限公司；BaP 标准品(纯度≥96%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；活性氧化铝、分子筛和硅胶(150 目，比表面积≥400 m2·g-1，孔容0.9 mL·g-1)，北京百灵威科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

RYX-25 型烟熏炉，嘉兴市瑞邦机械工程有限公司；Triplus SPME 自动进样器、Trace GC Ultra 气相色谱仪、DSQII 单四级杆色谱质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific 公 司； 100 μm 聚 二 甲 基 硅 氧 烷(polydimethylsiloxane，PDMS)萃取头，美国Supelco 公司；Waters 2695 高效液相色谱仪配2489UV/Vis 紫外检测器，美国Waters 公司；HGC-36 氮吹仪，天津恒奥科技发展有限公司；SK7200LHC 超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 烟熏即食鱼片的制备 首先将鱼肉解冻切成长5 cm、宽4 cm、厚1 cm 的鱼片，放入腌制液(盐76 g、糖6.6 g、姜6.6 g、味精6.6 g、料酒16.8 g 配成1 L 溶液)中腌制40 min。然后在室温条件下干燥30 min。最后在干燥温度40℃(烘箱中干制)，干燥时间30 min，烟熏温度85℃，烟熏时间30 min 条件下进行熏制[13]。

1.3.2 前置固相吸附剂装置 分别设棉花、活性氧化铝、分子筛和硅胶4 种前置固相吸附材料。将棉花平铺在200 目特制不锈钢网筛上至1 mm 厚，向内填充20 g 活性氧化铝、分子筛或硅胶，棉花作为吸附材料时，将其平铺在不锈钢网筛上约2 cm 厚，然后将其固定至出烟口。

1.3.3 BaP 含量测定 准确称取100 mg BaP 标准品，置于100 mL 棕色容量瓶，乙腈定容，制备浓度为1.0 mg·mL-1储备液，置于4℃冰箱中避光保存。精密吸取定量的标准品储备液，分别配制成质量浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 和1 μg·mL-1标准溶液，经0.22 μm 有机滤膜过滤后转移置样品瓶中。液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)条件为柱温30℃，流速0.8 mL·min-1，紫外检测器波长262 nm，流动相为乙腈水溶液(80 ∶20，v/v)，运行时间25 min，进样20 μL。经检测后根据样品浓度和BaP 信号峰面积绘制标准曲线[14]。

准确称取5 g 鱼片样品，研磨后移入150 mL 具塞锥形瓶，加入30 mL 2 mol·L-1KOH 溶液，塞紧瓶塞，置于70℃恒温水浴锅2 h；取出锥形瓶，加入30 mL 正己烷，超声提取30 min；再加入30 mL 水充分振荡，然后静置到正己烷相与水相分离。取15 mL上层正己烷相，经氮吹仪吹干，准确加入1 mL 乙腈，振荡溶解后，经0.22 μm 有机滤膜过滤，用于HPLC检测。通过比较样品与标准样品的保留时间进行定性分析，样品保留时间对应的峰值与标准曲线换算进行定量分析。

1.3.4 风味物质检测 将熏鱼肉剪碎，称取3 g 于10 mL 样品瓶中，60℃水浴30 min，推出纤维头萃取30 min 后取出，在进样口250℃解析3 min。萃取头第一次使用时，在气相色谱/质谱(gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS)进样口250℃老化2 h，以后每次使用前只需老化30 min。

GC/MS 分析采用TR-5MS 毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氮气，进样口温度250℃，流速1 mL·min-1，进样方式为不分流，起始温度35℃，保持6 min，以4℃·min-1升至80℃，8℃·min-1升至200℃，12℃·min-1升至250℃，保持5 min。电离方式EI，电子能量70 eV，灯丝发射电流200 μA，离子源温度230℃，接口温度250℃，扫描范围30～450 m/z[15]。

1.3.5 感官评价 挑选20 名经过感官培训的食品专业学生组成评价小组，从样品的色泽、质地、异味、烟熏味、回味等方面进行感官评价。所有样品统一评定，随机取样。评价人员的基本条件为身体健康，个人卫生良好，对感官分析具有较强的兴趣，没有抽烟的不良嗜好。在检测前不吃东西，不使用气味浓烈的香水与化妆品。评定过程中禁止讨论，评定限时15 min[16]。评定完一组样品后，用清水漱口再进行下一组样品的评定，具体评价标准见表2。

1.3.6 单因素试验与响应面优化试验 分别考察硅胶含量、烟熏温度和烟熏时间对烟熏鲟鱼中BaP 含量的影响，试验条件优化如下:不同硅胶含量(10 ～30 g)，不同烟熏时间(20～40 min)和不同烟熏温度(80 ～100℃)，测定各组烟熏鲟鱼样品中BaP 含量。

在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，选取前置固相吸附剂硅胶含量(X1)、烟熏时间(X2)、烟熏温度(X3)为自变量，烟熏鲟鱼片BaP 含量为因变量，进行三因素三水平的响应面设计，得到烟熏工艺的最优条件。响应面试验因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 The experimental design of factors and level tables

1.4 数据分析

每个样品平行测定3 次，结果以平均值±标准误表示，采用SPSS v17.0 进行差异显著性分析，使用Design-Expert 8.05 进行响应面试验设计与分析，并用Microsoft Word 2010、Origin 7.5 及Microsoft Excel 2010软件进行图表绘制。

表2 烟熏鲟鱼片的感官评价标准Table 2 The sensory evaluation criteria of smoked sturgeon fillets

2 结果与分析

2.1 不同前置固相吸附剂条件下烟熏鲟鱼片的感观评分

由图1 可知，不同前置吸附材料导致烟熏鲟鱼片的感官评分差距较大，其中未添加前置固相吸附剂与硅胶固相吸附的感官评价最好，且二者的得分区间较相近。棉花和活性氧化铝作为固相吸附剂时，烟熏鲟鱼片的烟熏味评分较低，说明二者对具有烟熏风味化合物的截留效果较好。以分子筛作为固相吸附剂的烟熏鲟鱼片色泽较淡，因为表面分子筛具有一定的脱色作用。此外，以分子筛为固相吸附剂会引入一定的异味，可能是因为烟熏味不能有效覆盖鱼片本身的腥味等异味。

图1 不同固相吸附剂条件下烟熏鲟鱼片的感观评分Fig.1 Sensory score of smoked fish fillets under different adsorbent conditions

2.2 不同前置固相吸附剂的BaP 含量测定

以浓度(μg·mL-1)为X轴，峰面积为Y轴，得到制备标准曲线回归方程为Y=296 623X，R2=0.999，结果表明在0.001 ～1 μg·mL-1范围内，质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合定量的标准。试验确定的色谱条件下BaP 的保留时间为14.4 min，通过保留时间与峰面积确定不同前置固相吸附剂条件下BaP 的含量，结果见图2。

结果表明，添加前置吸附剂与未添加组相比，烟熏鲟鱼片中BaP 含量明显下降，其中高分子材料(分子筛、活性氧化铝)的吸附效果最佳，棉花、硅胶的吸附效果次之。何智慧等[17]将高分子材料添加到卷烟滤嘴中，BaP 含量下降了24.5%。程占刚等[18]研制了高分子多孔过滤烟嘴，检测发现BaP 含量减少了35.0%。研究表明，硅胶对芳香烃化合物有一定的吸附作用，且经过优化的硅胶吸附效果较普通硅胶好[19]，而目前关于棉花对BaP 的吸附作用机制尚未确定。

图2 不同固相吸附剂条件下烟熏鲟鱼片中BaP 含量Fig.2 The content benzopyrene content under different sorbents

2.3 不同吸附剂下熏鱼的风味物质

挥发性物质通过在NIST 2.0 谱库中做自动检索分析，且仅当正反匹配度(SI/RSI)均大于800(最大值为1 000) 的鉴定结果才予以保留，所得主要的挥发性化合物种类和含量见表3。

表3 不同前置吸附剂条件下烟熏鲟鱼片风味物质分析结果Table 3 Analysis of flavor compounds of smoked sturgeon under different pre-adsorbent conditions

表3(续)

烟熏鲟鱼片的挥发性风味物质主要为酚类、醛类、酮类、醇类、酸类等化合物，酚类为烟熏食品的主要香味成分，具有抗氧化和防止腐败的作用[20]。由表3 可知，间甲酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2，6-二甲氧基苯酚是烟熏鲟鱼片的主要酚类物质。不同酚类赋予了烟熏食品多种多样的口感，如苯酚具有酚香，类似烟熏的香气，4-乙基创愈木酚具有香辛料和草药香气[21]。烟熏鲟鱼片中酚类化合物种类较丰富，相对含量占比47.69%。添加前置吸附材料后，烟熏鲟鱼片中的酚类物质发生了明显变化，以棉花作为固相吸附剂时变化最明显，几乎截留了熏烟中所有的酚类物质；活性氧化铝和分子筛作为固相吸附剂能吸附部分酚类化合物，使筛滤后的烟熏鲟鱼片中酚类化合物相对含量分别为32.10%和46.55%；硅胶作为固相吸附剂表现相对较优，检出的酚类化合物高达13 种，占比53.38%。醛类是酯类氧化分解的主要产物，其阈值虽大，但对风味也有促进作用[22-23]。未添加前置固相吸附剂时，烟熏鲟鱼片中检出3 种醛类，占比5.25%；添加前置固相吸附剂(棉花、活性氧化铝、分子筛、硅胶)后，烟熏鲟鱼片中检出的醛类种类分别为3 种、2 种、和2 种，其含量分别为2.75%、2.67%、3.57%、2.62%，差别较小，其中壬醛、糠醛是烟熏鲟鱼片的主要醛类风味物质。未添加前置固相吸附剂时，烟熏鲟鱼片中检出2 种酮类，占比1.63%，添加前置固相吸附剂后酮类化合物的相对含量反而有所上升。

2.4 响应面烟熏工艺的优化

上述研究结果表明，前置硅胶材料在有效降低熏烟鲟鱼片中BaP 含量的同时可较好地保留酚类、醛类等风味化合物，因此选定硅胶为固相吸附材料进一步优化烟熏工艺。

2.4.1 单因素试验分析 由图3 可知，在硅胶20 g和烟熏时间30 min 的条件下，随着烟熏温度的升高，烟熏鲟鱼片中BaP 含量增加，烟熏温度为80 ～85℃时，BaP 含量基本无变化，烟熏温度为85 ～100℃时，BaP 含量变化较快，这可能是高温使得鱼肉中的物质发生反应，故本试验选择85℃作为烟熏温度。

图3 烟熏温度对烟熏鲟鱼片中BaP 含量的影响Fig.3 Effect of smoking temperature on BaP content of smoked sturgeon fillets

由图4 可知，在硅胶20 g 和烟熏温度85℃条件下调节烟熏时间为20 ～30 min 时，烟熏鲟鱼片中的BaP含量几乎不变；烟熏时间为30～40 min 时，BaP 含量呈上升趋势。时间的长短会影响BaP 和风味物质的含量，因此本试验烟熏时间选取30 min。

由图5 可知，在烟熏时间30 min 和烟熏温度85℃时，不同硅胶含量对烟熏鲟鱼片BaP 含量的影响较大。随着硅胶含量的增加，烟熏鲟鱼片BaP 含量逐渐减少，当硅胶含量为10～20 g 时，烟熏鲟鱼片BaP 含量变化趋势较明显；当硅胶含量为20 ～30 g 时，BaP 含量变化相对较平缓。本试验还发现，随着硅胶含量的增加，BaP含量在减少的同时，挥发性风味物质的含量也同时减少，本试验选择20～25 g 作为硅胶吸附剂的含量范围。

图4 烟熏时间对烟熏鲟鱼片中BaP 含量的影响Fig.4 Effect of smoking time on BaP content of smoked sturgeon fillets

图5 硅胶含量对烟熏鲟鱼片中BaP 含量的影响Fig.5 Effect of silica gel content on BaP content of smoked sturgeon fillets

2.4.2 响应面优化试验设计与结果分析 通过Design-Expert 软件进行二次响应面回归分析，响应面试验方案和结果见表4，并得到多元二次响应面回归模型:Y=3.50-0.52X1＋0.19X2-0.86X3-0.28X1X2-0.13X1X3＋0.050X2X3＋0.60X12＋0.62X22＋0.58X32。

由表5 可知，模型的F值为9.46，P＜0.05，表明该模型可以用于模拟实际。3 个影响因素中，硅胶含量(X1)和烟熏温度(X3)的影响显著(P＜0.05)，3 个交互项的影响不显著，二次项X12、X22、X32 影响显著，说明BaP 含量主要受硅胶含量和烟熏温度的影响。校正决定系数=0.826，表明该试验中BaP 含量有82.6%的可能性都包含了回归方程模型的9 个因子中，说明模型合适。R2=0.924，说明本试验中BaP 含量的实际值与模型的预测值有较好的拟合度。变异系数CV=4.29%，CV 值低表示该试验准确，可靠性高。

表4 响应面实验方案及结果Table 4 Experimental scheme and results of response surface methodology

表5 回归模型方差分析表Table 5 Variance analysis table of regression model

2.4.3 响应面分析 由图6 可知，烟熏时间与硅胶含量、烟熏温度与烟熏时间的交互作用对烟熏鲟鱼片中BaP 含量的影响较弱，而烟熏温度与硅胶含量的交互作用对BaP 含量影响较大。与烟熏温度相比，硅胶含量所对应的曲面坡度更大，说明硅胶含量的变化对BaP 含量的影响较明显，随着硅胶含量的增加，鲟鱼片中BaP 含量有所下降，这是因为随着硅胶含量增加，BaP 的吸附量也随之增加。烟熏温度与烟熏时间所对应的曲面坡度较平，说明烟熏温度在80℃以上与烟熏时间在20 min 以上时，对BaP 含量影响不大。此外，硅胶含量与烟熏时间的交互作用对BaP 含量的影响较弱。与烟熏时间相比，硅胶含量所对应的曲面坡度较陡，表明硅胶含量对BaP 含量的影响显著。

图6 两因素交互作用对烟熏鲟鱼片中BaP 含量的影响Fig.6 Effect of interaction of two factors on BaP content of smoked sturgeon fillets

2.4.4 最优条件的确定及验证 利用Design-Expert软件对响应面试验结果进行分析，得到降低BaP 含量的最优工艺条件:硅胶含量23.5 g，烟熏时间29.6 min，烟熏温度82.9℃，此条件下烟熏鲟鱼片中BaP 含量为3.78 μg·kg-1。为方便试验操作，将最优条件调整为硅胶25 g，烟熏时间30 min，烟熏温度85℃，以此条件制备烟熏鲟鱼片，判定优化工艺额的准确性，最终测得鲟鱼片中的BaP 含量为3.89 μg·kg-1，与预测值相接近。

3 讨论

烟熏食品过程中所产生的BaP 等多环芳烃具有强致癌性，严重影响食用安全性，使消费者对烟熏食品产生忌讳。本研究通过前置在线筛滤装置，比较不同固相吸附材料(棉花、硅胶、分子筛、活性氧化铝)条件下，烟熏鲟鱼片中的BaP 含量。结果表明，几种固相吸附材料均能吸附一定量的BaP，其中分子筛的吸附效果最佳，其次分别为活性氧化铝、硅胶和棉花。该试验结果与温青青等[24]的研究结果相似。

本试验相比周红雷等[25]对鲳鱼烟熏工艺的优化，除了对比口感外，还对比分析了风味物质的含量。检出的挥发性化合物主要包括酚类、醇类、酮类、碳氢化合物、酸类、酯类、酮类等，其中酚类物质是烟熏食品中的特色挥发性化合物，添加前置吸附材料硅胶后，主要的芳香性酚类均有所保留。

感官评分包括色泽、回味、质地、烟熏味、异味等几类评价条件。本研究结果表明，不同前置吸附剂条件下，烟熏鲟鱼片的感官评分差距较大，其中硅胶吸附剂的感官评分较高且与未添加吸附剂相近，而棉花、分子筛、活性氧化铝吸附剂感官评分较低。后者大量截留了风味物质(酚类、醛类、酮类等)，导致感官评分较低。酚类是烟熏鲟鱼片的主要风味物质，除了能产生令人回味的滋味外，还能抑制细菌生长。许雪萍等[26]研究发现醛类物质是烟熏肉的主要挥发性风味物质，其中壬醛具有清香味道，醛类物质的产生来自不饱和脂肪酸。烟熏加工过程中产生的酮类物质主要来源于美拉德反应[27]，或脂肪的氧化[28]，烟熏阶段酮类作为中间产物通过氧化进一步分解形成其他产物[29]。

本研究进一步采用单因素优化硅胶含量、烟熏时间以及烟熏温度，并通过响应面研究不同因素之间的交互关系，确定最佳工艺参数。结果表明，以硅胶为前置吸附材料可实现在线筛滤熏烟中的BaP，并有效保留芳香性风味化合物，进而提高烟熏食品的安全性和感官品质。综上所述，本研究结果对开发新型健康的烟熏食品具有重要参考意义，后续有待进一步研究硅胶的重复利用性能和高效复合硅胶的开发。

4 结论

本研究建立了以硅胶为固相吸附材料在线筛滤熏烟中BaP 的技术，并制备了烟熏即食鱼片法。从感官评价、BaP 含量、风味物质的种类和含量等方面比较不同前置固相吸附材料对烟熏鲟鱼片的影响及工艺优化，结果表明，在硅胶含量25 g，烟熏时间30 min，烟熏温度85℃条件下使用前置硅胶吸附剂的烟熏鱼片感官评价最高，BaP 含量为3.89 μg·kg-1，挥发性风味成分中酚类物质含量最高(53.38%)。本研究采用的前置固相吸附剂对烟熏鱼片的开发具有重要意义。