草莓叶主要挥发性物质的测定及其对草莓球腔菌的抑菌效果

童志超 徐艳群 李 栋 李 莉 罗自生

(1浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；2浙江大学宁波研究院，浙江 宁波 315000；3 农业农村部农产品产后处理重点实验室，浙江 杭州 310058；4浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310058)

草莓蛇眼病由草莓球腔菌[Mycosphaerella fragariae(Tul.) Lindau](真菌半知菌亚门柱隔孢属杜拉柱隔孢Ramularia tulasneiSacc.)侵染所致，主要危害叶片，严重发生时，还可侵染叶柄、果柄、花萼、匍匐茎和果梗，且植株间传播性强[1-3]。在草莓种植地区，草莓蛇眼病是一种常见病害，可对草莓生产造成巨大的经济损失[4-5]。目前，草莓蛇眼病的防治方式主要以化学药剂防治为主，生态防治以及生物防治较少[6]。但化学药剂的长期使用会导致病菌产生抗药性，而且果蔬表面和环境中的农药残留，易引发食品安全及环境污染等问题[7-9]。因此，急需研制高效安全的生物农药防治植物病害。

植物自身可以产生多种天然挥发性物质，在植株与环境、植株与病害以及植株与植株之间的互作中具有重要作用[10-12]。研究表明，病虫害的侵染[13]、高温[14]、干旱[15]、高盐[16]等多种生物胁迫或非生物胁迫，均会引起植物体内挥发性物质释放量的增加，从而增强植株抗逆性，其中萜类和C6 醛类是挥发性物质的主要组成部分。另有研究表明，植物的挥发性物质具有高效的抑菌活性，在植物抗病性方面具有重要作用[17-19]。草莓挥发性物质能够在体外抑制灰霉病病原菌 (Botrytis cinerea)[20]和炭疽病病原菌(Colletotrichum acutatum)[21]的生长，但关于草莓天然挥发性物质对草莓球腔菌抑制作用的报道尚鲜见。本研究测定了草莓叶片中的主要挥发性物质成分，并研究了其对草莓球腔菌的抑菌作用，以期为应用环境友好型天然挥发性物质的新型高效抗菌剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌:草莓球腔菌，分离自草莓叶片上自然生长的蛇眼病，经分离、纯化、鉴定后保存备用，试验所用孢子为草莓叶片培养基培养，培养代数均在4 代以内。供试草莓幼苗品种名为阿尔比(Fragaria ×ananassa，Albion)，来自商业苗圃(乔司农场，杭州)。

1.2 试验方法

1.2.1 用于提取分离挥发性物质的草莓植株培养 采用常用植株培养基，盆栽于植物生长箱培养(花盆直径15 cm)，日光照连续14 h，培养温度为25±2℃(白天)和15±2℃(晚上)，相对湿度为50%±5%，采用氮磷钾(200 mg·L-1的氮，71 mg·L-1的钾和200 mg·L-1的磷)营养液给予草莓充足的营养，每周浇营养液3 次。每组9 株草莓植株，3 次重复，培养7 周后收集草莓叶片。

1.2.2 草莓叶片中主要挥发性物质的测定 采用顶空固相微萃取法富集-气相色谱与质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)检测草莓叶片中主要的挥发性物质及含量[22]。

取20 g 草莓嫩叶(刚完全展开)与饱和食盐水按照1 g ∶2.5 mL 混合并匀浆。称取3 g 匀浆样品置于15 mL 顶空瓶中，加入1 μL 300 μL·L-12，6-二甲基-6-庚烯-2-醇作为内标；40℃搅拌平衡15 min 后，插入DVB/CAR/PDMS 50/30 μm 固相微萃取头(美国Supelco)萃取30 min。萃取结束后，手动进样，进样口250℃解析3 min，采用6890 N 气相系统(美国Agilent)串联MS 检测器(5975 B，美国Agilent)进行检测。色谱柱参数:DB-5MS 色谱柱(美国Agilent):30 m×0.25 mm，0.25 μm；柱温程序:40℃保持3 min，以2℃·min-1升至64℃，然后以3℃·min-1升至145℃，再以15℃·min-1升至250℃(保留10 min)。各挥发性组分通过与质谱库(NIST05) 以及保留指数(kovats index，KI)进行比对来鉴别，通过内标定量。

KI 值的测定:按照上述质谱条件的对正构烷烃混合对照品C5～C20进行GC-MS 分析，记录各正构烷烃保留时间，根据线性升温公式计算各组分的KI 值[23]:

式中，tx表示被分析组分流出峰的保留时间，min；tn、tn＋1表示碳原子数为n 和n＋1 的正构烷烃流出峰的保留时间，min。tn＜tx＜tn＋1。

1.2.3 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌致病力的影响 取新鲜的刚完全展开的草莓嫩叶于90 mm培养皿中，每个培养皿1 片叶子，5 个培养皿为一组，试验重复3 次。平铺两层滤纸于叶片之下，向滤纸滴加1 mL 水，以保持叶片的湿度和完好的生理状态。将浓度为1×105个·mL-1的草莓球腔菌孢子悬液喷洒于叶片正面和反面进行人工接种；接种完成后，在培养皿盖子内部放置一张直径90 mm 的滤纸，然后分别将30 μL 的挥发性物质滴加在滤纸上，迅速将盖子盖回培养皿，并用封口膜密闭封口。设置萜类[芳樟醇(美国Sigma，97%)、桃金娘烯醇(美国Sigma，95%)]的浓度分别为0(对照)、5、50、100、150 μL·L-1，C6 醛类[己醛(上海阿拉丁，97%)、反式-2-己烯醛(上海阿拉丁，98%)、顺式-3-己烯醛(美国Bedoukian 研究公司，98%)的浓度为0(对照)、0.5、5、50、500 μL·L-1。将培养皿置于室温2 h 后将培养皿打开，将带有挥发性物质的滤纸移除，培养皿于无菌环境下敞口30 min(充分移除挥发性物质)后再封口。室温下再培养8 d后观察并记录草莓叶片的病斑面积。

1.2.4 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌孢子萌发及菌丝生长的影响 将100 μL 浓度为5×104个·mL-1的草莓球腔菌孢子悬液均匀涂布在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)上(每盘7 mL 培养基，约0.15 cm 厚，培养皿直径为90 mm)，静置10 min；在培养皿盖子内部放置一张直径90 mm 的滤纸，然后分别将一定体积的挥发性物质D-柠檬烯(美国Sigma，95%)、芳樟醇、桃金娘烯醇、己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛滴加在滤纸上，迅速将盖子盖回培养皿，并用封口膜密闭封口。挥发性物质所滴加的体积按照培养皿内挥发性物质最终浓度为0、0.05、0.5、5、50、500 μL·L-1进行处理。在滴加前用水按将挥发性物质1 ∶10、1 ∶102、1 ∶103、1:104稀释后，使得不同浓度的挥发性物质滴加相同的体积，不同种类的挥发性物质滴加体积控制在16～50 μL。

培养16 h 后在光学显微镜下随机选取9 个视野进行拍照(放大倍数为125)，然后利用显微镜capture软件对视野内的各菌体长轴向总长度进行测定和统计；每个视野内的菌体个数在6 以上，取每个视野的平均菌体长度作为一个平行。菌体伸长为孢子平均轴向长度(约41 μm)两倍以上视为萌发(＞82 μm)。孢子萌发率=视野内萌发的孢子个数/视野内所有的孢子个数×100%。对于16 h 未萌发的处理组，移除滤纸片，并将培养皿打开，在超净台上通风1 h 移除挥发性物质，然后再封口培养72 h，观察孢子萌发情况；若孢子再次萌发则该挥发性物质在该浓度下只具有抑制孢子萌发的作用，若孢子仍未萌发则视为该挥发性物质在该浓度下具有杀菌作用。

1.2.5 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌线粒体膜电位的影响 将100 μL 浓度为5×104个·mL-1的草莓球腔菌孢子悬液均匀涂布在PDA 培养基上，培养5 d 后，按照1.2.3 中的方法进行挥发性物质熏蒸处理16 h。芳樟醇、桃金娘烯醇处理浓度分别设为0(对照)、5、50、500 μL·L-1，己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛处理浓度分别设为0(对照)、0.5、5、50 μL·L-1。由于前期1.2.4 试验发现，当D-柠檬烯浓度高达500 μL·L-1时才对草莓球腔菌的生长有明显抑制作用，而高浓度对草莓叶片有明显损伤，因此后续试验未进行D-柠檬烯处理。处理结束后，从各组中挑取菌丝，利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(上海碧云天生物技术有限公司)对菌丝的线粒体膜电位进行检测。荧光强度通过共聚焦显微镜(SP8，莱卡，德国)进行检测，最终线粒体膜电位结果以红色荧光强度(激发波长525 nm，发射波长590 nm)与绿色荧光强度(激发波长490 nm，发射波长530 nm) 的比值表示。10 μmol·L-1的CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)细胞凋亡诱导剂处理作为阳性对照(CCCP 处理会使得菌丝线粒体膜电位完全丧失)，水处理作为空白对照。

1.3 数据分析

每组试验数据重复测定 3 次。方差分析(ANOVA)采用SAS 9.4 软件的一般线性模块(Proc GLM)进行分析。各组之间进一步采用最小显著性差异分析(least significant difference，LSD)，P＜0.05 代表差异显著。

2 结果与分析

2.1 草莓叶片中的主要挥发性物质

草莓叶片经GC-MS 检测其总离子流色谱图如图1 所示，利用NIST05 质谱库进行检索并对比挥发性物质的保留指数(KI)进行定性，利用面积归一化计算草莓叶片中主要挥发性物质的相对百分含量，结果如表1 所示。在草莓叶片中共检测出12 种主要挥发性物质，其中含量最高的是萜类和醛类，共占总量的95.58%。其中萜类物质有3 种，分别是桃金娘烯醇、芳樟醇和少量D-柠檬烯，约占总量的6.09%；C6 醛类物质主要包括2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛等，占总量的89.72%。萜类、醛类挥发性物质具有抗菌活性[24]，以草莓叶片中这些挥发性物质的自然含量为参考设定后续试验浓度，探究草莓叶片中天然存在的挥发性物质对草莓球腔菌的抗菌活性。

图1 草莓叶片总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatography of the volatile of strawberry leaves

2.2 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌致病力的影响

适当浓度的萜类、C6 醛类挥发性物质熏蒸处理能减小草莓蛇眼病病斑面积(图2)。当萜类挥发性物质处理浓度为5、50 μL·L-1时均能减小草莓叶片蛇眼病的病斑面积，其中处理浓度为50 μL·L-1时效果最好，几乎完全抑制了病原菌的侵染。C6 醛类挥发性物质中反式-2-己烯醛处理浓度为0.5、5 μL·L-1时均能减小草莓蛇眼病的病斑面积，其中0.5 μL·L-1效果最好；己醛和顺式-3-己烯醛最优处理浓度为5 μL·L-1，同时0.5 和50 μL·L-1浓度处理对于病害的发生也具有一定的防治效果。然而，过高浓度的挥发性物质熏蒸处理会对草莓叶片造成损害，当萜类挥发性物质浓度为150 μL·L-1时，草莓叶片病斑面积反而增加；此外，当萜类挥发性物质浓度为150 μL·L-1、C6 醛类挥发性物质中反式-2-己烯醛浓度为50 μL·L-1及更高、己醛和顺式-3-己烯醛浓度为500 μL·L-1时，叶片出现褐红色，8 d 后叶片几乎全部被草莓球腔菌侵染，均出现菌斑。

表1 草莓叶片中主要挥发性物质及其含量Table 1 Main volatile substances and contents in strawberry leaves

图2 挥发性物质对草莓球腔菌侵染草莓叶片的抑制作用Fig.2 Inhibition of volatile substances on strawberry leaves infected by Mycosphaerella fragariae

2.3 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌孢子萌发的影响

在正常情况下，草莓球腔菌孢子能够萌发与生长(图3-B)。挥发性物质能够抑制菌丝生长(图3-C)的最低浓度为最低抑菌浓度；适当浓度的挥发性物质能够抑制孢子的萌发，但移除挥发性物质后能够继续萌发(图3-D)，此时挥发性物质的浓度为抑菌浓度；挥发性物质浓度过高，能完全杀死草莓球腔菌，即使移除挥发性物质孢子仍不萌发，此时挥发性物质的浓度为杀菌浓度。

由表2 可知，在适当浓度下，草莓叶片挥发性物质熏蒸对草莓球腔菌孢子萌发具有显著抑制作用(P＜0.05)，且随着浓度的升高，对孢子萌发的抑制作用也随之增强。不同挥发性物质对草莓球腔菌孢子萌发的抑制浓度不同，D-柠檬烯抑菌浓度为500 μL·L-1，远大于草莓叶片中检测到的浓度且气味过于强烈，芳樟醇、桃金娘烯醇抑菌浓度为50 μL·L-1，己醛、顺式-3-己烯醛抑菌浓度为5 μL·L-1，反式-2-己烯醛抑菌浓度为0.5 μL·L-1，该浓度的挥发性物质对孢子萌发的抑制达到了显著水平(P＜0.05)。芳樟醇、桃金娘烯醇杀菌浓度为500 μL·L-1，己醛杀菌浓度为50 μL·L-1，反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛杀菌浓度为5 μL·L-1，该浓度下具有杀死病原菌的效果，草莓球腔菌孢子萌发率几乎为0，熏蒸处理后即使移除挥发性物质，孢子也不再萌发。

图3 不同生长状态的草莓球腔菌形态图Fig.3 Morphology of Mycosphaerella fragariae in different growth states

表2 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌子萌发的影响Table 2 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on spore germination of Mycosphaerella fragariae

2.4 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌菌丝生长的影响

如图4 所示，在适当的浓度下，草莓叶片主要挥发性物质熏蒸能显著抑制草莓球腔菌菌丝的生长，且随着浓度的升高，抑制效果越好。由表2 可知，D-柠檬烯最低抑菌浓度为500 μL·L-1，芳樟醇最低抑菌浓度为5 μL·L-1，桃金娘烯醇最低抑菌浓度为50 μL·L-1，己醛、反式-2-己烯醛最低抑菌浓度为0.05 μL·L-1，顺式-3-己烯醛最低抑菌浓度为0.5 μL·L-1时，该浓度下各挥发性物质对菌丝生长的抑制作用均达到显著水平。当D-柠檬烯浓度达到500 μL·L-1，芳樟醇、桃金娘烯醇浓度达到50 μL·L-1，己醛、顺式-3-己烯醛达到5 μL·L-1，反式-2-己烯醛浓度达到0.5 μL·L-1时，能够完全抑制菌丝生长。

图4 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌菌丝生长的影响Fig.4 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on mycelial growth of Mycosphaerella fragariae

2.5 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌线粒体膜电位的影响

草莓叶片主要挥发性物质熏蒸会影响草莓球腔菌的线粒体膜电位(图5)，与菌丝生长相对应，随着萜类、C6 醛类挥发性物质浓度的升高，草莓球腔菌菌丝的线粒体膜电位逐步下降，表明其可通过破坏草莓球腔菌的线粒体膜，进而影响菌体的生长。当所采用的3 种C6 醛类挥发性物质和2 种萜烯类挥发性物质浓度达到50 μL·L-1时，菌丝的膜电位均较正常生长显著降低。当芳樟醇浓度达到500 μL·L-1，反式-2-己烯醛的浓度达到50 μL·L-1时，菌丝的线粒体膜电位几乎完全丧失，与10 μmol·L-1CCCP 处理结果无显著差异，表明此时已经完全破坏草莓球腔菌线粒体。

3 讨论

图5 草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌线粒体膜电位的影响Fig.5 Effect of main volatile substances in strawberry leaves on mitochondrial membrane potential of Mycosphaerella fragariae

绿色植物叶片中主要的挥发性物质，也被称为“绿色叶片挥发性物质”(green leaf volatile，GLV)，主要包括C6 醇类、醛类、萜烯类及乙酸酯类化合物[28]。本研究发现，草莓叶片中的挥发性物质主要是萜类和醛类化合物，尤其是C6 醛类，如2-己烯醛、己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛，占主导地位，其次为萜类化合物，主要包括芳樟醇、桃金娘烯醇及少量D-柠檬烯。这与Ceuppens 等[29]关于草莓花器官挥发性成分的研究结果类似。不同植物的挥发性成分有所差异，但主要均是醇类、醛类和萜烯类物质，如葡萄叶片中顺式-3-己烯醇和反式-2-己烯醛的含量较高[30]，番茄植株中顺式-3-己醇与乙酸、丙酸等形成的挥发性酯含量较高[31]。

植物叶片中的挥发性物质是一种重要的诱导防御机制，能抑制植物病原菌的生长和繁殖[28]。Marei等[24]研究了多种单萜类挥发性物质对植物病原菌的抑菌活性，发现S-柠檬烯对病原菌具有较好的抑菌效果。本研究发现，草莓叶片中的萜类挥发性物质(芳樟醇、桃金娘烯醇)，以及C6 醛类挥发性物质(己醛、反式-2-己烯醛、顺式-3-己烯醛)，在适当浓度下具有显著抑制草莓球腔菌孢子萌发和菌丝生长的作用。不同类型的挥发性物质对草莓球腔菌抑制效果不同，其中在同一浓度下C6 醛类的抑菌效果普遍好于萜类挥发性物质，其抑制草莓蛇眼病的最低熏蒸浓度相差最少一个数量级。反式-2-己烯醛的抑菌效果最好，当其浓度达到0.5 μL·L-1时，对孢子萌发具有显著的抑制作用，而D-柠檬烯浓度则需要达到500 μL·L-1。Arroyo 等[21]研究了8 种草莓脂氧合酶途径产生的挥发性物质对草莓炭疽病病原菌的体外抑制作用，也发现反式-2-己烯醛是对菌丝生长抑制效果最好的一种挥发性物质，与本研究结果一致。

Arroyo 等[21]通过扫描电镜发现GLV 体外处理可以改变真菌细胞壁和细胞器的正常形态。本试验研究草莓叶片主要挥发性物质对草莓球腔菌线粒体膜电位的影响，发现当反式-2-己烯醛、己醛、顺式-3-己烯醛、芳樟醇和桃金娘烯醇浓度达到50 μL·L-1时，这些挥发性物质熏蒸处理较对应挥发性物质溶剂处理(空白对照)会显著降低菌丝的线粒体膜电位；继续提高挥发性物质浓度(反式-2-己烯醛浓度达50 μL·L-1)时，能完全破坏草莓球腔菌线粒体膜。表明挥发性物质熏蒸处理能够通过破坏线粒体膜电位来影响草莓球腔菌的能量代谢和呼吸链传递，从而干扰细胞的正常生理活动。

本研究中，草莓叶片中萜类挥发性物质芳樟醇、桃金娘烯醇及D-柠檬烯浓度为50 μL·L-1，己醛浓度为5 μL·L-1，反式-2-己烯醛浓度为0.5 μL·L-1，顺式-3-己烯醛浓度为5 μL·L-1时，利用挥发性物质熏蒸均能够表现出较好的抑菌效果且对叶片无任何损伤。但浓度过高则会对草莓叶片带来损害，处理后的叶片会出现褐红色，8 d 后叶片几乎全部被草莓球腔菌侵染，这可能是由于挥发性物质能够使草莓叶片细胞受到损害，从而导致叶片更容易受到病原菌的侵染[32]。Neri等[33]研究发现叶片受损时挥发性物质在受损部位浓度会上升，病原菌可感知叶片的受损伤部位信息，而病原菌可能会利用挥发性物质传递的信号，从而更容易侵入。

4 结论

本研究表明，草莓叶片中主要挥发性物质是萜类化合物以及C6 醛类化合物。采用草莓叶片中的天然挥发性物质熏蒸对草莓蛇眼病具有较好的抑菌效果，芳樟醇、桃金娘烯醇最低熏蒸浓度为50 μL·L-1，己醛最低熏蒸浓度为5 μL·L-1，反式-2-己烯醛最低熏蒸浓度为0.5 μL·L-1，顺式-3-己烯醛最低熏蒸浓度为5 μL·L-1，此浓度下挥发性物质能够有效抑制草莓球腔菌的侵入，表现出较好的抑菌效果且对草莓叶片无明显损伤，具有良好的应用前景。草莓叶片中主要挥发性物质能有效抑制草莓球腔菌孢子萌发和菌丝生长，并使其线粒体膜电位下降。本研究为应用环境友好型、绿色无污染天然挥发性物质有效抗菌剂提供了依据。