不同茬次和高度热研四号王草的乳酸菌分布及青贮发酵品质

陈鑫珠，张建国

（1.华南农业大学南方草业研究中心，广东 广州510642；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州350013）

热研四号王草（Pennisetum purpereum×P.typhoideumcv.Reyan No.4）属禾本科狼尾草属多年生草本植物，由中国热带农业科学院从国际热带农业中心引进并经多年试验选育而成［1］，是我国南方种植面积最大的优良牧草之一，但其生产具有鲜明的季节性，因此在产草旺季对其加工贮存尤为重要［2−3］。刈割是牧草管理的常规方式，刈割时期、次数、频次对牧草产量与品质的影响有较多研究报道［4−12］。高赟等［4］研究表明，饲用玉米（Zea mays）刈割次数增加，其粗蛋白（crude protein，CP）、粗纤维（crude fiber，CF）、干物质（dry matter，DM）、磷、钙的含量下降，鲜草胡萝卜素含量呈现先上升后下降趋势，但刈割次数不影响粗灰分和粗脂肪含量。陈晓东等［5］报道，大麦（Hordeum vulgare）第1 茬饲草产量与品质均高于第2 茬。雷荷仙等［6］报道，茬次对多花黑麦草（Lolium multiflorum）的营养成分及细胞壁各物质含量有明显影响，其粗灰分、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量随刈割茬次的增加而增加，而粗蛋白则随刈割茬次的增加而降低。吕仁龙等［7］报道，青贮前和青贮后，王草中叶绿素和叶绿醇含量均随着刈割高度的增加而显著降低。多花黑麦草第2茬青贮效果优于第1 和3 茬［8］。综上所述，茬次和高度对牧草的营养成分和青贮发酵品质有显著影响，然而关于刈割茬次和高度对牧草乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）分布的研究却鲜有报道。有研究表明牧草刈割茬次改变了土壤细菌群落结构［13］，但对地上部分牧草植株细菌群落是否影响未见研究报道。本研究旨在研究刈割茬次和高度对热研四号王草的乳酸菌分布和青贮发酵品质的影响，以便为我国南方地区热研四号王草合理利用和大规模青贮推广应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其种植管理概况

热研四号王草2011 年2 月28 日种植于华南农业大学增城宁西试验基地，N 23°14′，E 113°38′。该地属亚热带季风气候，年平均气温为21.6 ℃，7 月最热，平均气温达33.7 ℃，极端最高气温39.1 ℃；最冷为1 月，平均气温为14.9 ℃，极端最低气温4 ℃。全年积温7910.9 ℃，年平均降水量为1801.2 mm，年平均太阳辐射值为4367.2～4597.3 MJ·m−2，年平均日照时数为1707.2 h。试验区土壤类型为水稻土，土壤基础肥力为有机质10.2 g·kg−1，全氮0.85 g·kg−1，全磷0.62 g·kg−1，全钾14.82 g·kg−1，速效氮32.35 mg·kg−1，速效磷76.19 mg·kg−1，速效钾85.42 mg·kg−1，pH 为5.40。于2011 年5 月25 日采集第1 茬1.0、1.5 和2.0 m 样本，2011 年8 月23 日采集第2 茬1.0、1.5 和2.0 m 样本，2011 年11 月5 日采集第3 茬1.0、1.5 和2.0 m 样本。

1.2 试验设计

采用双因素分析热研四号王草3 个茬次（第1、2 和3 茬）和3 个高度（1.0、1.5 和2.0 m）的乳酸菌的数量和种类分布、营养特性及青贮发酵品质。

材料采集：每个样品戴无菌手套距地面10 cm 用灭菌后的剪刀剪取2 份试验所需材料，装入无菌封口袋（一份约100 g 用于微生物分析，一份约500 g 用于青贮调制），放置冷藏箱中冷藏，带回实验室立即分析。

1.3 分析方法

取备好的微生物分析样本，在超净工作台内每个样本称取50 g，用无菌剪刀剪成10 cm 左右，放入无菌聚乙烯袋中，加入250 mL 无菌洗脱液（0.1 mol·L−1磷酸钾−0.1%吐温缓冲液，pH 7.0），将空气排尽封口，在200 r·min−1摇床中振荡30 min。开封后，先取10 mL 洗脱液预留做划板培养，其余洗脱液用50 mL 离心管收集，采用高速冷冻离心机（台式高速冷冻离心机H1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）14000 r·min−14 ℃离心10 min，收集沉淀，−20 ℃冰箱保存［14］。

取青贮调制样品，每个样本称取3 份150 g 用无菌剪刀剪至1～2 cm 混合均匀的原料，装入聚乙烯袋中，抽真空、密封。常温条件下贮存60 d 后开封，取样分析青贮料发酵品质和化学成分。

将每个样品预留的10 mL 洗脱液进行101～106梯度稀释后，分别采用MRS 琼脂培养基（MRS agar medium，MRS）、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）进行乳酸菌、好氧性细菌、酵母菌和霉菌划板培养后计数［14］。乳酸菌用厌氧箱（YQX-Ⅱ型，上海新苗）37 ℃培养2 d；好氧性细菌、酵母菌和霉菌在有氧条件下30 ℃培养2 d。

MRS 组成及配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母提取物5.0 g、葡萄糖5.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二胺2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1.0 L，pH 调至6.8，121 ℃高压灭菌25 min。

NA 组成及配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1.0 L，pH 调至7.0，121 ℃高压灭菌25 min。

PDA 组成：葡萄糖20.0 g、马铃薯浸出液粉4.0 g、琼脂15.0 g、蒸馏水1.0 L，121 ℃高压灭菌25 min，再用灭菌酒石酸调pH 至3.5。

不同刈割高度和茬次所取样品按常规方法放置105 ℃烘箱杀青30 min 后，置65 ℃烘箱干燥48 h 测得干物质（DM）；缓冲能（buffer capacity，BC）采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定［15］；参考《饲料分析及饲料质量检测技术》［16］测定风干样本的粗蛋白质（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和半纤维素（hemi-cellulose，HC）含量；可溶性碳水化合物（water soluble-carbohydrate，WSC）采用Anthrone 比色法定量［17］，同时取10 mL 的浸提液，在浸提液中加入少量阳离子交换树脂，离心机12000 r·min−1离心10 min，用0.22 μm 微孔滤膜过滤后，采用LC-20AT高效液相色谱仪测定棉子糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和果糖，色谱条件：色谱柱（SUGAR P0810，日本），流动相为超纯水，流速0.8 mL·min−1，柱温75 ℃，检测器为RID-10A 紫外检测器［14］。

取具代表性青贮样品20 g 加入80 mL 蒸馏水，放置4 ℃冰箱中8 h 后滤纸过滤收集滤液，测定滤液的pH；取5 mL 滤液加入树脂经12000 r·min−1离心10 min 后取上清液，该上清液再用孔径0.22 μm 的滤膜过滤后，采用LC-20AT 高效液相分析仪（色谱柱：Shodex Rspak KC-811S-DVB gel Column 30 mm×8 mm；检测器：SPDM10AVp；流动相：3 mmol·L−1高氯酸）测定乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）含量［18］。

1.4 乳酸菌的鉴定

乳酸菌分离与纯化参考张慧杰等［19］的方法进行，形态学和生理生化特性检测参考凌代文等［20］的方法进行。纯化后将不同形态、生理生化表现的乳酸菌株进行全长DNA 提取，并采用乳酸菌通用引物进行扩增，扩增后的PCR 产物送华大生物科技有限公司（中国，广州）测序，获得16S rDNA 序列信息后与GeneBank 基因库中16S rDNA 序列进行比对［21］。

1.5 数据统计分析

用Excel 对数据进行整理，采用SPSS 17.0 软件对数据进行方差分析，采用Duncan 法对均值进行多重比较，对材料特性进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同茬次和高度下热研四号王草的特性

茬次对热研四号王草的DM、CP、WSC、pH、BC、ADF、HC、棉籽糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖和乳酸菌数量均有极显著（P＜0.01）影响，对NDF 有显著（P＜0.05）影响；高度对DM、CP、WSC、BC、pH、NDF、ADF、麦芽糖含量均有极显著（P＜0.01）影响，对蔗糖、葡萄糖和果糖含量有显著（P＜0.05）影响；茬次和高度对CP、WSC、pH、NDF、蔗糖、麦芽糖和果糖有极显著（P＜0.01）的交互作用，对BC、ADF、葡萄糖和乳酸菌数量有显著（P＜0.05）的交互作用（表1）。

表1 不同茬次和高度下热研四号王草的特性Table 1 The characteristic of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

热研四号王草第1 茬的pH 值、ADF、棉籽糖、蔗糖、麦芽糖和果糖的含量显著（P＜0.05）高于第2 和3 茬，NDF、HC 和LAB 数量显著（P＜0.05）低于第2 和3 茬；第2 茬的DM、HC 和霉菌的数量显著（P＜0.05）高于第1和3 茬，CP 和ADF 显著（P＜0.05）低于第1 和3 茬；第3 茬的BC、葡萄糖和酵母菌数量显著（P＜0.05）高于第1 和2 茬，WSC 显著（P＜0.05）低于第1 和2 茬。

热研四号王草1.0 m 高度的CP 和pH 值显著（P＜0.05）高于、NDF 显著（P＜0.05）低于1.5 和2.0 m 高度；1.5 m 高度的麦芽糖显著（P＜0.05）高于、蔗糖和果糖显著（P＜0.05）低于1.0 和2.0 m 高度；2.0 m 的DM、NDF和ADF 显著（P＜0.05）高于、pH 值显著（P＜0.05）低于1.0 和1.5 m 高度。

2.2 不同茬次和高度下热研四号王草的青贮发酵品质

不同茬次和高度下热研四号王草的青贮发酵品质及两因素方差分析见表2。茬次对热研四号王草青贮料的pH、乙酸和丁酸含量均有极显著影响（P＜0.01），对青贮料的乳酸有显著（P＜0.05）影响；高度对青贮料的pH 和乙酸有极显著（P＜0.01）影响，对青贮料的DM 和氨态氮有显著（P＜0.05）影响；茬次和高度对pH 值有极显著（P＜0.01）的交互作用，对氨态氮有显著（P＜0.05）的交互作用。

表2 不同茬次和高度下热研四号的发酵品质Table 2 The fermentation characteristics of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

热研四号王草青贮料中，第1 茬的丁酸和氨态氮含量显著（P＜0.05）高于第2 和3 茬；第2 茬pH 显著（P＜0.05）低于第1 和3 茬，乳酸含量显著（P＜0.05）高于第1 和3 茬；第3 茬乙酸含量显著（P＜0.05）低于第1 茬。

热研四号王草青贮料中，1.0 m 高度的乙酸含量显著（P＜0.05）高于1.5 和2.0 m 高度；1.5 m 高度的氨态氮含量显著（P＜0.05）高于1.0 和2.0 m 高度；2.0 m 高度DM 含量显著（P＜0.05）高于1.0 和1.5 m 高度，pH 值显著（P＜0.05）低于1.0 和1.5 m 高度。

2.3 不同茬次和高度下热研四号王草乳酸菌的分布

从热研四号王草3 个茬次的3 个不同高度共分离了122 株乳酸菌，依形态、生理生化、碳源发酵特性进行分组，对各组的代表菌株的16S rDNA 测序、分析比较，发现有5 种乳酸菌存在，分别是Lactobacillus属的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）、Lactococcus属的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和Weissella属的融合乳杆菌（Weissella confuse）和魏斯氏菌（Weissella cibaria）（表3）。

表3 代表菌株测序NCBI 比对结果Table 3 NCBI comparison results of the representative strains

表4 不同茬次和高度下热研四号王草分离乳酸菌的数量和种类Table 4 The number and kinds of LAB of different cutting and height of Reyan No.4 king grass

其中第1 茬的1.0、1.5 和2.0 m 植株中植物乳杆菌占绝对优势，分别为93.33%、93.55%和83.33%，1.0 m植株中有少量的乳酸乳球菌（6.66%），1.5 和2.0 m 中有少量的戊糖乳杆菌（6.66%和16.67%）；第2 茬中1.0 m植株植物乳杆菌占64.28%，融合乳杆菌和魏斯氏菌分别占28.57% 和7.14%，1.5 m 植株融合乳杆菌占78.55%，植物乳杆菌占21.42%，从2.0 m 植株只分离到融合乳杆菌；第3 茬1.0 m 植株植物乳杆菌占57.14%、乳酸乳球菌7.14%、融合乳杆菌28.57%和魏斯氏菌7.14%，1.5 m 植株只分离到植物乳杆菌和融合乳杆菌，分别占66.66%和33.33%，2.0 m 植株主要是融合乳杆菌（84.61%）和少量的魏斯氏菌（15.38%）（表4）。

3 讨论

刈割是提高牧草饲用价值的有效方式，刈割茬次与饲草品质密切相关［22］，但因不同饲草品种，不同种植管理方式、不同种植地点等因素不同营养指标在不同研究报道中结果不完全一致。陈晓东等［5］报道，刈割的茬次和高度对饲草的营养成分和青贮品质均有影响，随着饲草高度的增加，其干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量逐渐升高，粗蛋白含量逐渐降低，本试验结果与此相似。在1.0～2.0 m 高度，热研四号王草的干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著升高，粗蛋白含量和pH 值显著降低。这与植物的生长发育和生理特性有关，植物在幼嫩时期，粗蛋白和水分含量较高，纤维较细较少［23］。苏晓菲［24］报道，适当增加刈割次数和有机肥施量可有效提高产量和改善品质，但刈割次数和有机肥施量过多对产量和品质的影响不大，不同刈割次数处理下，紫花苜蓿（Medicago sativa）的产量和粗蛋白含量均随着有机肥施量的增加而呈上升趋势，中性及酸性洗涤纤维均随着有机肥施量增加呈现下降趋势。杨恒山等［25］和王丽霁［26］的研究表明，随着生长季中刈割次数增多，粗蛋白含量及产量均显著提升，粗纤维含量及产量均显著下降。于辉等［27］研究表明，随着刈割次数的增加，苏丹草（Sorghum sudanense）的粗纤维水平降低。何振富等［22］研究发现，中性洗涤纤维含量品种间对刈割茬次的响应程度不一致，酸性洗涤纤维含量品种间对刈割茬次的响应一致，因此表现不同的原因与品种不同有关。另外，他还发现对相同品种的营养成分动态变化中，中性洗涤纤维和酸性洗涤含量均呈“升—降—升”的变化趋势。董志国等［28］研究表明，新牧1 号紫花苜蓿第1 茬的粗蛋白含量显著最高，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的变化规律为第3 茬＞第1茬＞第2 茬。罗燕等［8］报道，75%水分多花黑麦草第1 茬的干物质和可溶性碳水化合物含量显著高于第2 和3 茬，第2 茬的粗蛋白含量显著最高，而65%水分第1 茬的粗蛋白和可溶性碳水化合物显著高于第2 和3 茬，第3 茬的酸性洗涤纤维最高，其表明第1 茬的多花黑麦草营养成分最高。尉志霞等［29］和Morin 等［30］研究报道，苜蓿第1 茬的营养成分优于第2 茬。本试验与报道结果不完全一致，热研四号王草原料中第2 茬的干物质含量显著高于第1 和3 茬，中性洗涤纤维第1 茬显著最高，酸性洗涤纤维第1 茬显著最低，这可能与牧草品种、种植区域和管理方式等不同有关，但第1 茬的粗蛋白含量和可溶性碳水化合物的含量显著最高与各报道结果一致。

青贮发酵主要影响因素有可溶性碳水化合物、含水量、温度、厌氧条件及其他等［31−32］。在无任何添加剂处理情况下，影响饲草青贮发酵的主要因素为饲草含糖量和附生的乳酸菌数量。有报道［21］表明，原料中的含糖量直接影响青贮品质。一般而言，青贮原料中的可溶性碳水化合物含量应为鲜重的3%以上或为干物质含量的6%以上方可制成优质青贮饲料，含糖量过低时（低于2%）则难以制成优质青贮饲料［31，33−34］。本试验不同茬次和高度间青贮品质均有显著差异，其中第2 茬的pH、乙酸、丁酸和氨态氮含量较低，干物质和乳酸含量最高，青贮品质较佳；3个高度中，2.0 m 的干物质和乳酸含量较高，pH 值和氨态氮含量较低，效果较佳。这与蒋利芳等［35］在紫花苜蓿裹包青贮品质的研究中认为第2 茬青贮品质优于第1 茬和罗燕等［8］在黑麦草75%和65%水分青贮中认为第2 茬的青贮发酵品质最优的报道结果相似。这与尉志霞等［29］和Morin 等［30］在紫花苜蓿上报道的第1 茬的青贮品质优于第2 茬的结果不同。可能是第2 茬的营养成分高于第3 茬，虽然低于第1 茬，但因第2 茬附生的乳酸菌含量显著高于第1 茬，其进行了更充分的乳酸发酵，保留更多的营养物质［8］，故第2 茬青贮料的干物质含量显著最高。因此，满足优质青贮含糖量的条件下，乳酸菌就成为青贮发酵的关键因素［36］。糖分是乳酸菌发酵时的底物，只有充足的底物含量，才能促进乳酸菌的快速、大量繁殖，使乳酸菌产生足够数量的乳酸［37］，提高青贮发酵品质，抑制不良菌的生长繁殖，保留较多的青贮料养分［34］。本试验中第2 茬和2.0 m 高度中乳酸菌含量最高，与本试验青贮品质最佳组的趋势相符，再一次证明附生乳酸菌在青贮发酵中的关键作用。

张慧杰［38］报道，不同茬次的苜蓿上附生的乳酸菌数量上无显著差异，原料干物质升高，苜蓿表面的乳酸菌的数量逐渐增多，有害菌的数量逐渐减少。Holden 等［39］发现在第1 次刈割和第2 次刈割期间，乳酸菌的数量呈上升趋势。不同茬次、高度、生育期和部位的植物乳酸菌数量和种类存在很大差异，且不同植物品种表现不同［40］。因此，不同茬次和高度的饲草表面乳酸菌种类和数量有一定的差异，但目前关于这方面深入的研究报道较少，仅有的报道也只是采用划板培养法研究乳酸菌数量差异［39］。本研究划板培养结果表明，热研四号王草第2 和3 茬乳酸菌的数量显著高于第1 茬，2.0 m 高度乳酸菌数量较多，但3 个高度统计学上无显著差异。不同茬次和高度样本中分离到的乳酸菌进行种类鉴定后发现，植物乳杆菌和融合乳杆菌是热研四号王草的高频乳酸菌，第1 茬的乳酸菌种类较少，第3 茬的乳酸菌种类较多。

4 结论

1）随着热研四号王草刈割高度增加（1.0～2.0 m），DM、NDF 和ADF 含量显著升高，CP 含量和pH 值显著降低；第2 茬的DM 含量最高，第1 茬的CP、WSC 和ADF 含量最高，NDF 含量最低。 2）3 茬热研四号王草青贮料中，第2 茬的青贮效果优于第1 和3 茬；3 个高度青贮料中，2.0 m 高度的青贮效果较佳。3）第2 和3 茬乳酸菌的数量显著高于第1 茬，第3 茬的乳酸菌的种类高于第1 茬；2.0 m 高度乳酸菌数量较多。4）植物乳杆菌和融合乳杆菌是热研四号王草出现频率最高的乳酸菌。