血浆外泌体miRNA-221对非小细胞肺癌的诊断价值

冉凤英 彭伟东 陈浩 武伦 罗丹 刘经健 杨光义 梅全喜冯光军 周文波 陈琴华

湖北医药学院附属东风医院1实验中心，2药学部（湖北十堰442008）；3深圳市宝安纯中医治疗医院药学部（广东深圳518101）

肺癌是全球范围内最常见的癌症之一，占所有癌症的11.6%［1］。并且，肺癌也是癌症相关死亡的主要原因，占全球所有癌症相关死亡的18.4%［2］。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，而受检测方法的限制，发现时患者大多发展为晚期了［3］。因此有待对找到可靠稳定的早期诊断生物标志物进行研究。研究［4］表明，外泌体在肺癌的诊断及治疗中发挥了重要作用，外泌体为各种细胞分泌的直径为30 ～200 nm的双囊泡结构［5］，普遍存在于血液、尿液、唾液、乳汁等体液中，携带多种脂质、核酸和蛋白质，参与细胞间的信息交流，介导肿瘤的发生及发展过程［6-8］。微小RNA（micro RNA，miRNA）是一种内源性非编码RNA 小分子，长度通常为18 ～24 个核苷酸［9］。研究发现，血浆中的外泌体可以增强循环miRNA 的稳定性，可反映来源供体细胞的疾病状态，还可通过采取外周血进行检测［10-11］，故为肿瘤的早期诊断及治疗提供了新的契机。本研究选择了已有文献报道肺癌血中表达升高的miR-221，选择实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测NSCLC患者和健康对照组血浆外泌体miR-221 的表达情况，并分析其与临床病理参数之间的关系，初步探讨其对肺癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2018-2019年来湖北省十堰市国药东风总医院就诊的NSCLC 患者的血浆72 例和健康体检人员的血浆52例，NSCLC 标本为经组织病理学检查确诊的患者，其中男42 例，女30 例，年龄44 ～76 岁；根据美国国家综合癌症网络提出的《非小细胞肺癌指南》中的分期标准，可将NSCLC 标本分为早期（Ⅰ、Ⅱ期）43 例，晚期（Ⅲ、Ⅳ期）29 例。纳入标准：（1）在手术切除前，所有的NSCLC 患者均未进行放疗和化疗等治疗措施；（2）手术前生化指标血常规、肝功、肾功能均正常；（3）所有受试者均无肺癌家族史；（4）近2年无其他呼吸系统疾病史。健康对照组标本为体检人员，排除高血压、糖尿病等多种疾病，无全身各系统恶性肿瘤疾病病史，其中男30 例，女22 例，年龄39 ～70 岁。本研究经国药东风总医院伦理委员会审核，研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与仪器ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit 试剂盒购自德国Qiagen公司（77023），Trizol试剂购自美国Thermo Scientific 公司（10296010）；cDNA 反转录试剂和RT-qPCR 德国Qiagen 公司（218161，218073）；抗体CD9 购自美国Abcam 公司（ab92726），抗 体TSG101 购自美国Abcam 公司（ab125011）；miRNeasy Serum/Plasma Spike-in control 购自德国Qiagen 公司（秀丽线虫cel-miR-39，219610）；引物购自德国Qiagen 公司（218300）。

低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）；透射电子显微镜（美国FEI 公司，Tecnai G220 TWIN）；荧光定量PCR 仪（澳大利亚Corbett Research 公司）；梯度PCR 仪（美国ABI 公司）；紫外可见分光光度计（日本Hitachi 公司）。

1.2.2 血浆外泌体的分离及鉴定临床采集研究对像静脉血约5 mL，500 g 离心取上清，标记做好标记后置于-80 ℃保存。室温溶解血浆，4 ℃，3 000 r/min离心5 min，取上清即血浆标本。采用ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit 试剂盒提取血浆外泌体，整个提取过程依据试剂说明书进行操作。获得的外泌体样品采用透射电子显微镜观察其形态，采用Western blot 检测外泌体表面蛋白标志物CD9、TSG101，采用Nanosight 检测外泌体的粒径分布和浓度。

1.2.3 血浆外泌体miRNA提取及浓度测定、逆转录合成cDNA首先向血浆外泌体样品中加200 μL Trizol 裂解15 min，选择硅胶模吸附柱提取纯化外泌体miRNA，并使用ND-100UV 微量紫外分光光度计测定样品的RNA 浓度及纯度。选择加尾法对提取的外泌体miRNA 进行逆转录得cDNA 样品，采用SYBR 法，对外泌体miRNA 进行定量检测。本实验采用相对定量法，外泌体样品加入Trizol 裂解后，加秀丽线虫的cel-miR-39 作为外源对照基因，采用△Ct 进行数据分析（△Ct=Ct miR-221-Ct miR-39）。

1.2.4 统计学方法实验数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料的非正态分布两组间比较采用Mann-WhitneyU检验。miR-221 表达水平连续性变量若满足正态性分布则以均数±标准差表示，非连续性变量采用用中位数（四分位数）表示。根据qRT-PCR 结果（2-△Ct）建立受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）法分析血浆外泌体miR-221 对非小细胞肺癌的诊断价值，并计算曲线下面积（area under curve，AUC）、特异性和灵敏度，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较72 例NSCLC 组中男42 例、女30 例，平均年龄（61.64 ± 1.01）岁；52 例健康对照组男30 例、女22 例，平均年龄（50.40 ± 4.03）岁。72 例NSCLC 组与52 例健康对照组间性别、年龄、吸烟史临床资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 NSCLC 组和对照组临床资料比较Tab.1 Comparison of characteristics between NSCLC group and control group

2.2 血浆外泌体鉴定本实验对提取的血浆外泌体形态、直径、标志蛋白、浓度及粒径分布进行了鉴定。在透射电子显微镜下观察到提取的外泌体直径为100 nm 左右（图1A），Western blotting 结果显示对照组和肺癌组血浆外泌体均表达外泌体标志性蛋白TSG101 和CD63（图1B），Nanosight 检测结果显示外泌体的粒径分布为123.6 ～241.8 nm，平均粒径为159.4 nm，外泌体的总浓度为2.38×1011个颗粒/mL，见图1C。

图1 血浆外泌体鉴定Fig.1 Identification of plasma exosomes

2.3 两组受试者血浆外泌体miR-221 表达水平比较健康对照组和NSCLC 组患者血浆外泌体miR-221 的表达水平见图2，结果显示NSCLC 组的miR-221 相对表达量3.651，（0.557，4.208）高于健康对照组1.310（0.079，1.388）。两组间差异有统计学意义（Z= 4.887，P＜0.001）。

图2 miR-221 在健康对照组和NSCLC 组血浆外泌体中的相对表达量Fig.2 The level of miR-221 analyzed in NSCLC patients and healthy controls

2.4 血浆外泌体miR-221对NSCLC 的诊断价值评估为进一步评估血浆外泌体miR-221 在NSCLC与健康人之间的诊断价值，采用ROC 曲线进行分析，见图3。血浆外泌体miR-221曲线下面积AUC为0.758（95%CI：0.672～0.844，P＜0.001），敏感度为86%，特异度为66%。结果提示miR-221 的表达在NSCLC 中确有升高的趋势，血浆外泌体中的miR-221 有望成为非小细胞肺癌潜在的生物标志物。

图3 血浆外泌体miR-221 表达量诊断非小细胞肺癌的ROC 曲线Fig.3 ROC curve of the diagnostic value of plasma exosomal miR-221 for NSCLC

2.5 血浆外泌体miR-221 与NSCLC 患者临床病理参数的关系收集72 例数据齐全的NSCLC 患者血浆外泌体临床病理数据，见表2，miR-221 的表达量采用中位数（四分位数间距）表示。在临床病理因素中，NSCLC 组患者血浆外泌体miR-221的表达量与肿瘤淋巴结转移（P= 0.015）、局部浸润程度（P= 0.045）以及TNM 分期（P= 0.011）差异有统计学意义（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤病变大小差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 NSCLC 患者血浆外泌体miR-221 表达量与临床病理参数关系Tab.2 The relationship between the expression of plasma exosomal miR-221 and the clinical pathological parameters in NSCLC patients M（P25，P75）

3 讨论

外泌体是由多种细胞分泌的直径为50 ～220 nm的膜性小囊泡［12］，在人体体液中广泛存在，如：尿液、血清、血浆、胸腔积液、唾液和乳汁等［13］。外泌体包含多种生物分子，如：蛋白、脂质、miRNA、mRNA 和lncRNA 等［14］，近年来研究［15-17］发现，外泌体能够反映其来源细胞的生物学特性和细胞的疾病状态，因此，外泌体被认为是一种极具潜力的肿瘤早期诊断生物标志物。

miRNA 是一种长度约为18 ～25 个核苷酸的单链、非编码RNA 分子，与肿瘤的发生发展和细胞信号分子传递密切相关［18-19］，目前的研究表明外泌体中有大量miRNA 分子，且外泌体中的miRNA分子与全血中的miRNA 分子表达谱差异有统计学意义［10-20］。因此，研究外泌体中的miRNA 分子具有重要意义。迄今为止，尚未发现miR-221 在非小细胞肺癌血浆外泌体中的表达水平与临床病理参数关系的相关报道。本研究首先采用透射电子显微镜观察外泌体的形态、Western blotting 检测外泌体特异性蛋白TSG101 和CD63、Nanosight 检测提取的外泌体浓度及粒径分布，证明血浆中存在大量的外泌体。其次，通过对72 例NSCLC 和52 例健康对照者血浆外泌体RNA qRT-PCR 检测发现miR-221在NSCLC 患者血浆外泌体中高表达，结果提示外泌体miR-221 可能与NSCLC 的发病机制密切相关，但这一结论尚需进一步的实验进行验证。血浆外泌体miR-221 曲线下面积AUC 为0.758（95%CI：0.672 ～0.844，P＜0.001），敏感度为86%，特异度为66%。结果提示血浆外泌体miR-221 对NSCLC 的诊断效能较高。最后，对NSCLC 临床病理参数与miR-221 相对表达量的关系进行了分析，NSCLC 组患者血浆外泌体miR-221 的表达量与肿瘤淋巴结转移、局部浸润程度以及TNM 分期差异有统计学意义（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤病变大小差异均无统计学意义（P＞0.05）。综上，血浆外泌体中miR-221 可能成为NSCLC 临床诊断的特异生物标志物。

近年来，随着研究的深入，血清、血浆、组织及细胞中的miRNA 在NSCLC 中的研究越来越多，KANG 等［21］发现miR-211 在非小细胞肺癌组织和细胞系中的表达水平增加，并且miR-211 的过表达促进细胞增殖和侵袭；GAO 等［22］发现miR-539 通过wnt8b 抑制NSCLC 细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭和促进细胞凋亡，提示miR-539 可能是NSCLC治疗的一种新的潜在诊断和治疗靶点。随着人们对外泌体作为肿瘤生物标志物的不断深入研究，外泌体中的miRNA 越来越成为研究的热点，VALLABHAENI 等［23］发现间充质干细胞外泌体通过传递miR-21 和miR-34a，促进乳腺癌细胞的增殖和转移；ZHOU 等［24］发现肺腺癌患者血浆外泌体中的miR-19-3p、miR-21-5p 和miR-221-3p 表达上调，认为血浆中的miRNA 是肺腺癌诊断的潜在生物标志物；此外，目前的一些研究也表明可以从NSCLC 患者的血清或血浆中成功分离外泌体，并采用qRTPCR 技术对其miRNA 进行鉴定［25-26］。综上所述，血浆外泌体中的miRNA 已成为一种新型的生物标志物被广泛研究，本研究已证明miR-221 在NSCLC患者血浆外泌体中高表达，对NSCLC 具有较好的诊断效能，后续将加大样本量深入研究miR-221与NSCLC 的相关性，为其成为诊断非小细胞肺癌的新型生物标志物提供更充分的理论依据。