中晚期结直肠癌外周血循环肿瘤细胞检测的临床意义

胡招兵，贾志红，王仁杰，吴颖虹，祝淇滢

景德镇市第二人民医院1肿瘤科，2病理科，江西 景德镇 333000

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，早期症状不明显，确诊时多属中晚期，导致治疗效果和预后不佳。目前临床常用的检查手段有影像学检查、肿瘤标志物、肠镜、病理活检等，然而受限于射线损害、有创性或特异度不高且仅能发现肉眼可见的复发、转移，不能及时发现血液中的微小转移灶等因素，导致对于更早期的病变无效。因此，如何有效监测肿瘤进展并准确判断预后一直是结直肠癌研究领域的热点。为了解决这些缺陷，以便更全面评估预后以及改善患者生活质量，需要找到更加敏感、有效的预测指标。液体活检技术应运而生，主要包含循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体（exosome）、微小RNA（microRNA，miRNA）等技术应用于血液、浆膜腔积液等检测[1]。伴随分子生物技术的飞速发展，促使CTC的高效检测成为可能。本研究探讨中晚期结直肠癌外周血CTC计数变化，以期为该类患者的治疗及预后评估提供重要的参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月至2020年6月景德镇市第二人民医院经病理证实为结直肠癌患者的病历资料。纳入标准：病理确诊为结直肠癌；临床分期为Ⅱ～Ⅳ期；美国东部肿瘤协助组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分≤2分；生存时间＞4周；首次采集CTC时患者未行任何治疗。排除标准：未明确诊断或合并其他类型的恶性肿瘤；有严重心肺疾病、自身免疫性疾病、血液病、长期口服抗凝药或合并严重感染无法接受抗肿瘤治疗；临床资料信息不完整。根据纳入、排除标准，共纳入结直肠癌患者36例，其中男性21例，女性15例；年龄 45～89岁，平均（69.83±8.16）岁；临床分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期18例，Ⅳ期8例。选取同期收治的22例肠道良性病变患者为对照，其中男13例，女 9例；年龄 38～86岁，平均（61.72±7.09）岁；慢性炎症12例，溃疡性结肠炎3例，炎性息肉4例，克罗恩病3例。结直肠癌患者和肠道良性病变患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 化疗方法 结直肠癌患者接受常规化疗奥沙利铂+卡培他滨（XELOX）方案，第1天予以130 mg/m2奥沙利铂静脉滴注，第1～14天1000 mg/m2卡培他滨片口服，每3周重复一次。化疗第2周期结束后进行CTC检测。

1.2.2 CTC检测方法 取肘正中静脉血4 ml于ACD抗凝剂真空采血管，采血后立即轻柔颠倒混匀防止出现溶血或血块。将血全部移至50 ml离心管中，滴入工作液CS1至45 ml离心（1900 r/min，5min），弃上清滴CS2至45ml于垂直混匀仪（20r/min，8～10 min）。吸取 150 μl磁微粒混悬液至 2 ml EP管中，置于磁力架上1 min后弃上清，滴加1 ml CS1重复洗涤3次，用CS1重悬磁微粒定容100 μl。50 ml离心管中滴加3 ml CS3，将加入磁微粒中的所有液体轻轻叠加到CS3顶层，离心（1400 r/min，5 min）。轻柔吸取最上2层溶液于15 ml离心管中，滴CS1至14 ml，混匀离心（2300 r/min，室温，5 min），弃上清，滴1 ml CS1，吹打细胞沉淀，置于磁力架上2～3 min，离心（3400 r/min，3 min），弃上清至 100 μl，加入100 μl CF1固定液，吹打混匀≥10次，涂片，取1×CF2固定液200～300 μl完全覆盖标本区域，室温8 min后吸去CF2，核酸杂交漂洗液中静置10 min，梯度酒精脱水各2 min，晾干待用。避光吸取10 μl 8号/7号染色体着丝粒探针（centromeric probe，CEP），封住盖玻片边缘。原位杂交仪变性（76℃5 min）、杂交（37℃1.5 h），清洗，滴加 200 μl抗体，孵育（37℃ 1 h），10 μl 4，6-二脒基苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染，镜下观察或置于2～8℃避光保存。

1.3 CTC判读标准

①单个细胞，核质均匀，未发现分层；②信号3个，且在胞核上；③红色通道下CD45不显色；④细胞表面无磁珠。经过鉴定符合上述标准的细胞，可认为是上皮组织来源的肿瘤细胞，即CTC。本研究将满足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP7+/CD45-/DAPI+的细胞视为阳性细胞，CEP8/CEP7阳性≥2时，判读为CTC阳性[2]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验及Fisher确切概率法；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTC阳性率的比较

结直肠癌患者CTC阳性率为63.89%（23/36），高于肠道良性病变患者的0%（0/22），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 不同临床特征的结直肠癌患者CTC阳性率的比较

TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的结直肠癌患者的CTC阳性率分别高于TNM分期为Ⅱ期、无淋巴结转移的结直肠癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别及是否远处转移结直肠癌患者的CTC阳性率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的结直肠癌患者CTC阳性率的比较（ n=36）

2.3 化疗前后CTC阳性率的比较

化疗后结直肠癌患者CTC阳性率为22.22%（8/36），明显低于化疗前的63.89%（23/36），差异有统计学意义（χ2=13.251，P＜0.01）。

3 讨论

恶性肿瘤已然成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一，其中结直肠癌跃升为世界第三大恶性肿瘤[3]。中国结直肠癌发病率居恶性肿瘤第三位，病死率居第五位[4-5]，并呈逐年上升趋势。伴随手术、放化疗等综合手段的应用，结直肠癌患者5年和10年生存率达到65%与58%，但仍有半数左右的患者在肿瘤进展过程中出现复发、转移、死亡[6]。

CTC指由原发或转移灶进入血液循环系统后大多数被消灭，只有极少数以单个细胞或细胞簇形式存活的肿瘤细胞，并导致肿瘤复发转移。健康人血液中也存在极少量的CTC（≤1个），而在肿瘤尤其伴有转移患者中其表达水平显著升高[7-8]。2010年美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）首次把CTC纳入肿瘤TNM分期系统后[9]，有研究证实CTC数量与淋巴结转移密切相关，阳性患者CTC数量明显多于阴性患者[10]。目前CTC已在肺癌[11]、头颈部恶性肿瘤[12]、食管癌[13]、胃癌[114]等肿瘤的诊治过程中获得较高的临床价值。本研究中肠道良性病变患者均未检出CTC，说明本次研究采用的阴性富集联合免疫荧光原位杂交技术（immunofluorescence-fluorescence in situ hybridization，im-FISH）检测方法的特异度较高。结直肠癌患者CTC阳性率为63.89%，这与Wang等[18]和苟苗苗等[19]的研究结果趋于一致。本研究发现CTC阳性主要集中在TNM分期中的Ⅲ～Ⅳ期患者，占76.92%，淋巴结转移患者占76.00%，且分期越高、CTC计数有升高趋势，说明CTC有助于评估肿瘤患者的TNM分期及淋巴结转移，进而评价预后。

2018年AJCC将CTC纳入乳腺癌的预后评估，认为乳腺癌患者外周血中存在CTC提示预后不良[15]。同期一项关于早期乳腺癌患者的大样本、多中心临床试验研究表明化疗后CTC的存在是总生存期和无进展生存期的独立预测指标，且CTC计数越多，危险度越高，预后越差[16-17]。本研究发现化疗后CTC阴性结直肠癌患者28例，提示这部分患者在化疗过程中，CTC被化疗药物在一定程度上有效清除，说明化疗方案有效果。李柔等[20]动态监测卵巢癌化疗前后CTC水平发现，依据CTC计数评价疗效与实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumor，RECIST）之间的吻合度较高，且CTC表达水平与化疗疗效呈负相关，本研究结果也有相似的趋势。因此，有理由相信CTC检测可作为评估结直肠癌疗效的有效指标，动态监测其变化可评价疗效及预后，实现真正的个体化治疗，提高患者生存获益。对于CTC尚未转阴的患者是否继续治疗除与患者的经济状况、身体耐受情况等因素有关外，是否把CTC阳性作为继续治疗的依据尚存在一定争议，还需要大样本研究进一步证实。不过有学者认为CTC持续阳性是接受化疗的晚期结直肠癌患者无进展生存期和总生存率的独立危险因素[21]。

近年来，靶向治疗、免疫治疗已然成为肿瘤治疗的热点。CTC作为术后肿瘤标本的唯一来源，不仅能完整表达肿瘤组织的生物学特性，且样本容易获取。伴随对CTC基因表型的分析，体外细胞耐药实验以及对肿瘤的耐药/治疗靶点的不断深入研究，CTC作为靶向治疗位点将变为可能[22]。由于本研究时间较短、样本量偏少，对于CTC与临床疗效、预后等信息的关联性还有待下一步的研究。