铀胁迫对不同苔藓光合特性及矿质营养代谢的影响

邓章轩，赖金龙,2，张 宇，罗学刚,2

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心，四川 绵阳 621010）

【研究意义】核电行业的发展为我国国防和经济建设带来巨大利益的同时，也留下了许多需要环境治理的铀矿区。矿区土壤含铀量和辐射量是一般土壤的几十倍，容易通过雨水污染周边环境，对动植物生长发育造成伤害[1-2]。生物修复技术由于操作性强、成本低廉且不会造成二次污染，被认为是最具潜力的环境修复技术。但矿区环境存在水土流失、土层稀薄等问题，难以满足一般维管束植物的立地条件。苔藓作为先锋植物被广泛用于恶劣环境的生态修复，研究苔藓植物对铀胁迫的生理响应，筛选适用于铀污染修复的苔藓植物，提高生物修复效率，对改善和修复铀矿区生态环境具有重要意义。

【前人研究进展】铀以铀酰离子（UO22+）的化合形式与碳酸盐、硫酸盐等形成可溶化合物，被植物吸收后引起植物不同部位出现氧化应激和细胞氧化还原失衡现象，导致植物叶片枯黄，生物量下降[3-4]。铀胁迫会干扰植物的光合作用，叶绿素荧光技术能反映植物受到铀胁迫时光合系统中光能传递、利用和耗散等相关信息[5-6]。邓闻杨等[7]通过凤眼莲的荧光生理特性变化研究微生物对凤眼莲铀富集能力的影响；韩旭等[8]利用叶绿素荧光技术研究铀胁迫对两种植物的光合系统的影响，以评价两种植物对铀胁迫的耐受性。此外，铀胁迫能影响植物对营养物质的吸收和转运，扰乱植物的新陈代谢。研究表明，UO22+会与Ca2+抢夺细胞膜上结合位点，降低细胞膜上的稳定性，改变矿质元素的渗透性[9]，导致植物矿质营养代谢紊乱[10-11]。苔藓植物体型矮小、结构简单，表面无角质层覆盖，对重金属污染敏感，常被用于环境重金属污染研究[12-14]。衣艳君等[15]研究发现Pb2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+复合胁迫能抑制尖叶走灯藓的最大光合效率（Fv/Fm），降低光合系统的电子传递速率和捕光能力。魏海英等[16]研究发现Pb、Cd胁迫会降低苔藓植物叶绿素含量，并抑制苔藓植物的K元素的吸收。苔藓植物生命力强，能够适应恶劣的生长环境[17-18]。研究表明，苔藓植物对重金属的富集能力强于地衣和维管植物[19]，可考虑作为铀矿区环境污染的监测和修复植物，然而目前关于苔藓植物对铀胁迫的生理响应研究较少。

【本研究切入点】以灰藓原变种（Hypnum cupressiformeL. ex Hedw. var.cupressiforme）、大羽藓（Thuidium cymbifolium）和东亚砂藓（Racomitrium japonicum） 3种苔藓为试验材料，研究铀胁迫对苔藓植物的叶绿素荧光生理特性和矿质元素积累的影响以及3种苔藓对铀的积累能力。【拟解决的关键问题】为苔藓植物用于修复和监测环境铀污染提供数据参考和科学依据，探究苔藓植物用于铀矿区环境修复的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年夏在西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心进行。选用苔藓品种为灰藓原变种、大羽藓和东亚砂藓，均采自西南科技大学青义校区内。苔藓采回实验室后，挑除里面的杂草树枝，用去离子水反复冲洗数次以去除表面杂质，再将苔藓放入霍格兰营养液中适应培养3 d，最后挑选生长状态良好的苔藓作为试验材料。

1.2 试验方法

以硝酸铀酰〔UO2（NO3）26H2O〕为铀源，根据铀胁迫对其他植物产生较强毒害作用的浓度[7,20]以及苔藓植物对其他重金属的耐受浓度[21-22]，设0、2.5、5、10、20 mg/L 5个铀胁迫浓度处理，依次记为CK、T1、T2、T3、T4，每个处理3次重复。为避免铀酰离子（UO22+）与磷酸盐形成沉淀，试验选用改良Hoagland’s营养液[23]。称取适量硝酸铀酰配制成相应铀浓度的营养液，将苔藓植物放置在含铀营养液中，光照培养72 h。设置培养箱温度为25 ℃，湿度80%，光照周期为14 h∶10 h，光照强度为2 000 lx[24]。培养72 h后，用蒸馏水冲洗苔藓3次，滤纸吸干表面水分，测其叶绿素含量、叶绿素荧光参数、铀累积量以及矿质元素含量。本试验所用药剂均为分析纯。

1.3 扫描电镜和能谱分析

取3种苔藓对照和铀胁迫浓度20 mg/L处理的叶片，用蒸馏水冲洗后，用电镜固定液固定24 h。将固定后的叶片用蒸馏水清洗数次，液氮快速冷冻，放入真空冷冻干燥机干燥。干燥后的苔藓叶片喷金后，用场发射扫描电子显微镜观察并拍照[24]，用ImageJ 软件测量叶片绒毛长度。

1.4 叶绿素含量测定

称取0.2000 g苔藓样品叶片，剪碎后放入研钵，加入95%乙醇5 mL和适量石英砂，研磨后定容至10 mL，用离心机3 000 r/min离心5 min，取上清液，用分光光度计在665、649 nm处测定吸光度值，计算叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）、总叶绿素（Chl a+b）含量（g）及叶绿素a/b[25]。

式中，V为提取液体积（mL），W为植物鲜重（g）。

1.5 叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光参数采用MINI-PAM便携式荧光测定仪测定。将样品暗适应20 min后，测其最大光化学量子产量Fv/Fm、光化学淬灭系数qP、非光化学淬灭系数qN、实际光化学量子产量Y（Ⅱ）[21]。

1.6 矿质元素和铀含量测定

将苔藓样品于105 ℃杀青后，置于85 ℃烘箱中烘干，然后用微型植物粉碎机粉碎，过0.075 mm筛后取0.1000 g样品粉末，加9 mL HNO3和1 mL H2O2，用微波消解仪消解后用去离子水定容至50 mL，过滤后使用原子吸收分光光度计测定矿质元素含量[23]。称取样品粉末0.2000 g，放入制样模具中，使用玻璃棒将样品测试面平整，封口后用X射线荧光光谱分析仪测定U的含量[27]。

试验数据使用DPS 7.05软件进行单因素方差分析和Tukey多重比较，采用Microsoft Excel 2007作图，采用Adobe Illustrator CC 2019进行图片排版。

2 结果与分析

2.1 铀胁迫对3种苔藓叶绿素含量的影响

铀胁迫对3种苔藓植物叶绿素含量影响情况如表1所示。大羽藓的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量以及灰藓原变种的叶绿素a含量在铀胁迫浓度2.5 mg/L下发生显著降低，东亚砂藓的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在铀胁迫浓度10 mg/L下发生显著降低，说明东亚砂藓对铀胁迫的耐受性强于灰藓原变种和大羽藓。当铀胁迫浓度升高至为20 mg/L，3种苔藓的叶绿素含量均降到最低值，灰藓原变种、大羽藓和东亚砂藓叶绿素a含量分别降低57.4%、72.1%、49.6%，叶绿素b含量分别降低40.9%、75.0%、49.4%，总叶绿素含量分别降低50.7%、72.8%、49.5%。3种苔藓中，大羽藓的叶绿素含量降幅最大，首次出现显著降低的胁迫浓度最低，说明大羽藓对铀胁迫的敏感性最高，东亚砂藓对铀胁迫的耐受性最好。灰藓原变种叶绿素a/b值在20 mg/L铀胁迫下较对照显著降低24.4%，说明叶绿素a对铀胁迫更敏感。

表1 铀胁迫下3种苔藓植物的叶绿素含量Table 1 Chlorophyll contents of three bryophytes under uranium stress

图1 铀胁迫对3种苔藓植物叶绿素荧光参数的影响Fig. 1 Effects of uranium stress on chlorophyll fluorescence parameters of three bryophytes

2.2 铀胁迫对3种苔藓光合特性的影响

3种苔藓的最大光化学量子产量Fv/Fm、有效量子产量Y（Ⅱ）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学荧光淬灭系数qN对铀胁迫的响应如图1所示。低浓度铀胁迫（2.5 mg/L）下，3种苔藓的Fv/Fm未出现显著变化，东亚砂藓的Y（Ⅱ）和qP及灰藓原变种的qN出现显著升高。当铀胁迫浓度升至10 mg/L时，灰藓原变种的Y（Ⅱ）、qP和qN均出现显著升高并达到最高值，大羽藓的Y（Ⅱ）、qP和 qN则出现显著降低。当铀胁迫浓度达到20 mg/L，灰藓原变种的Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP和qN较铀胁迫10 mg/L下皆有降低，大羽藓的Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP和qN均出现显著降低并达到最低值，东亚砂藓的qN则出现显著升高。说明铀胁迫对敏感性较高的苔藓品种（大羽藓）的叶绿素荧光参数均表现为抑制作用，耐受性较好的品种多表现为“低促高抑”，如灰藓原变种的Y（Ⅱ）、qP、qN和东亚砂藓的Y（Ⅱ）、qP。东亚砂藓的Y（Ⅱ）和qP在低浓度铀胁迫（2.5 mg/L）下出现显著升高，Fv/Fm和qN表现为无变化和显著上升，因此不能确定东亚砂藓对铀胁迫的最高耐受浓度。灰藓原变种对铀胁迫耐受的最高浓度为10 mg/L，大羽藓对铀胁迫的敏感性最高，铀胁迫浓度≥5 mg/L部分叶绿素荧光生理参数开始出现显著降低。

2.3 不同苔藓铀累积能力分析

扫描电镜图片（图2）显示，3种苔藓的叶片表面均附着绒毛，表2显示3种苔藓中大羽藓的叶片绒毛长度显著大于灰藓原变种和东亚砂藓，铀处理后叶片绒毛长度并未出现显著变化；能谱分析结果显示，高浓度铀胁迫（20 mg/L）下，3种苔藓叶片表面均存在铀元素。表3显示，大羽藓的铀累积量在各处理间均显著高于灰藓原变种和东亚砂藓。20 mg/L铀胁迫下，大羽藓的铀累积量为灰藓原变种的1.37倍、东亚砂藓的1.34倍。说明铀胁迫对苔藓植物叶片绒毛长度无显著影响，大羽藓的叶片绒毛长度大于灰藓原变种和东亚砂藓，对铀的累积能力优于灰藓原变种和东亚砂藓。

2.4 铀胁迫对3种苔藓矿质营养代谢的影响

图2 铀胁迫苔藓扫描电镜及能谱分析Fig. 2 SEM and EDS analysis of bryophytes under uranium stress

表2 3种苔藓叶片的绒毛长度Table 2 Length of leaf villi of three bryophytes（μm）

表3 不同品种苔藓对铀的累积量Table 3 Accumulation of uranium in different bryophytes（mg/kg, DW）

图3 铀胁迫下3种苔藓植物矿质元素含量变化Fig. 3 Changes of contents of mineral elements in three bryophytes under uranium stress

3种苔藓的矿质元素对铀胁迫的响应趋势如图3所示。铀胁迫下大量元素K含量在灰藓原变种和大羽藓中显著升高16.1%和10.3%，在东亚砂藓中无变化；Ca含量在灰藓原变种和东亚砂藓中显著升高41.3%和341%，在大羽藓中表现为“低促高抑”现象，在2.5 mg/L时取得最大值，较对照显著升高17.6%，胁迫浓度继续上升则出现显著降低。说明一定浓度的铀胁迫能促进苔藓植物吸收大量元素K、Ca，胁迫浓度过高则会抑制，对铀胁迫敏感性较高的大羽藓最先出现显著降低。灰藓原变种和大羽藓的大量元素Mg出现显著降低，东亚砂藓无显著变化，Mg元素为叶绿素重要组成部分，东亚砂藓对铀胁迫的耐受性较好，Mg元素未表现出显著下降。

微量元素中灰藓原变种的Fe、Mn、Cu、Mo含量出现显著变化，最高值较对照分别显著升高7.9%、21.8%、42.6%和432%；大羽藓的Fe、Mn、Mo含量最高值较对照显著升高68.4%、29.3%和321%；东亚砂藓的Zn、Mn、Mo含量最高值较对照显著升高73.9%、27.1%和257%。其中Mo含量在3种苔藓中皆呈上升趋势，升幅最大，说明铀胁迫能促进苔藓植物对Mo元素的吸收；Fe、Mn、Cu、Zn含量在3种苔藓中变化趋势各不相同，说明铀胁迫对苔藓植物微量元素的影响存在种间差异，需要进一步深入研究。

3 讨论

与其他高等植物一致，叶绿素含量变化也是苔藓植物受到环境胁迫时的生理响应之一。刘涛等[22]研究发现Pb2+、Zn2+及二者复合胁迫对西南树平藓的叶绿素含量均抑制显著。董萌等[27]研究表明，东亚金发藓叶绿素含量与土壤中镉浓度呈反比例关系，镉胁迫会使苔藓叶片枯黄萎蔫，甚至枯亡。本研究结果与前人研究结果相似，苔藓植物的叶绿素含量与铀胁迫浓度均呈反比例关系。大羽藓的叶绿素含量和灰藓原变种的叶绿素a含量在低浓度铀胁迫（2.5 mg/L）下出现显著降低，东亚砂藓的叶绿素含量出现显著变化的铀胁迫浓度10 mg/L，高浓度铀胁迫（20 mg/L）下大羽藓的叶绿素含量降幅最大，说明3种苔藓对铀胁迫的敏感性依次为大羽藓＞灰藓原变种＞东亚砂藓。高浓度铀胁迫下叶绿素a/b在灰藓原变种中出现显著降低，说明叶绿素a对铀胁迫更加敏感，但大羽藓和东亚砂藓中并未出现显著变化，因此叶绿素含量变化作为筛选铀污染修复植物的指标需要考虑叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的含量。

叶绿素荧光参数能反映植物受到重金属胁迫时植物光合作用变化，韩旭等[9]研究发现，水芹和铜钱草的Fv/Fm随着铀胁迫浓度增加而降低。李华丽等[28]发现高浓度铀胁迫可使植物PSⅡ的Fv/Fm降低，严重威胁植物存活。本研究发现3种苔藓的叶绿素荧光参数对铀胁迫响应变化不一致。Fv/Fm能反映植物潜在的最大光合效率，Y（Ⅱ）反映植物实际光合效率。随着铀胁迫浓度增加，灰藓原变种和大羽藓的Fv/Fm在较高浓度铀胁迫（≥10 mg/L）下出现显著降低，灰藓原变种和东亚砂藓的Y（Ⅱ）表现为“低促高抑”，大灰藓的Y（Ⅱ）表现为被抑制，说明苔藓植物的实际光合效率对铀胁迫更敏感，容易产生显著效应，一定浓度的铀胁迫能提高耐受性较好的苔藓植物的实际光合效率。光化学淬灭系数（qP）和非光化学猝灭系数（qN）反应吸收的光能用于光化学和热能的部分。灰藓原变种和东亚砂藓的qP随着铀浓度呈“低促高抑”现象，说明低浓度铀胁迫促进苔藓植物的光合活性，浓度过高则抑制。灰藓原变种qN表现为“低促高抑”，东亚砂藓qN显著升高，大羽藓的qN、qP均被抑制，说明灰藓原变种和东亚砂藓可能通过将光能更多的转换为热能的方式以减少铀胁迫对其PSⅡ的伤害。铀胁迫对大羽藓的毒害性较强，使其PSⅡ结构受损，导致光合活性和光保护能力同时受到抑制，实际光合效率下降[29]。

龚双姣等[30]研究发现对铅耐受性最强的尖叶拟船叶藓对铅的富集量最多。本研究发现，对铀敏感性较高的大羽藓，对铀富集量各处理间皆显著高于耐受性较好的灰藓原变种和东亚砂藓。有学者认为认为苔藓植物对重金属的富集能力和敏感性存在种间差异，主要受苔藓植物比表面积、表面特征结构及持水能力影响[31]。本研究结果显示，苔藓植物叶片的绒毛长度与铀累积量呈正比例关系，大羽藓的叶片绒毛长度大于灰藓原变种和东亚砂藓，更容易吸附和滞留铀离子，可能是大羽藓铀累积量大于灰藓原变种和东亚砂藓的原因之一。此外，耐受性较好的苔藓品种为了阻止重金属离子进入体内，会形成相应的阻隔屏障，降低重金属在体内的运输效率，以减少对细胞的损伤，如匐枝青藓通过细胞壁表面形成的有效屏障抑制对Pb元素的吸收以耐受600 mg/L的Pb毒害作用[31]，这也可能是耐受性较好的东亚砂藓和灰藓原变种的铀富集量低于大羽藓的原因。结合铀在岩石、土壤、水和生物体中平均含量约为4 mg/kg[32]，接近大羽藓对铀胁迫的最高耐受浓度5 mg/L，大羽藓对铀污染更加敏感，对铀污染易产生显著生理响应，相同浓度铀胁迫下铀富集量高于灰藓原变种和东亚砂藓，因此大羽藓更适合用于环境铀污染的监测和修复研究。

矿质元素平衡是植物维持正常生理活动的必需条件之一，重金属胁迫可使植物矿质元素吸收、转运和代谢异常。K、Ca、Mg是植物生长发育所需的大量元素。本研究发现，铀胁迫下，K、Ca含量分别在两种苔藓中表现为显著上升，与谢亚兵等[33]关于Cd胁迫对芳樟K、Ca吸收的影响研究结果相似，原因可能是较低的浓度铀胁迫使苔藓植物增加对K、Ca的吸收，促进呼吸和光合作用相关酶的活性，加快糖类的转运，以抵抗铀胁迫对细胞的伤害。大羽藓的Ca含量表现为 “低促高抑”，这与魏海英[34]对Pb-Cd复合胁迫下大羽藓Ca含量研究结果相似，结合大羽藓叶片表面结构容易滞留铀离子，推测原因是叶片表面大量被吸附的铀离子破坏了细胞膜结构稳定性，使Ca含量降低。灰藓原变种和东亚砂藓对铀的累积能力弱于大羽藓，还未表现出下降趋势。两种苔藓的Mg含量出现显著下降，推测是因为叶绿素的分解导致苔藓植物细胞Mg含量降低。

微量元素是组成植物生长代谢相关酶的重要成分之一。本研究结果显示，铀胁迫下东亚砂藓Fe，Zn、Mn含量表现为 “低促高抑”，与刘帅等[35]关于Cd胁迫下菜心地上部Fe、Zn、Mn含量变化研究结果相似，灰藓原变种和大羽藓的Fe含量呈下降趋势，原因可能是低浓度的铀胁迫使东亚砂藓胞内氧化还原反应效率升高，促进Fe吸收，而灰藓原变种和大羽藓在低浓度铀胁迫时细胞色素解体，导致Fe含量降低。3种苔藓的Mo含量均表现为上升，而且在高浓度铀胁迫（20 mg/L）有一个较大幅度提升，推测苔藓植物可能通过促进氮代谢能力以抵抗铀胁迫伤害，但还需要进一步研究铀胁迫下苔藓的氮代谢相关酶活性加以验证。

4 结论

本研究结果表明，苔藓植物的叶绿素含量与铀胁迫浓度呈反比例关系；叶绿素荧光生理参数在敏感性较高的苔藓中表现为被抑制，对铀耐受性较好的苔藓中多表现为“低促高抑”；一定铀胁迫能够促进苔藓植物对大量元素K、Ca含量的吸收，浓度过高则会抑制；因此叶绿素含量、叶绿素荧光生理特性及大量元素K、Ca含量可作为筛选铀污染监测和修复植物的生理指标。

大羽藓叶绿素含量出现显著变化的铀胁迫浓度最低，叶绿素含量降幅最大，对铀胁迫的敏感性较东亚砂藓和灰藓原变种最高，叶绿素荧光生理参数显示大羽藓对铀胁迫的最高耐受浓度为5 mg/L，接近铀在岩石、土壤、水和生物体中平均含量，且对铀的富集能力优于灰藓原变种和东亚砂藓，可作为监测以及修复环境铀污染的优选苔藓植物。