O2/CO2 自发气调对香菇保鲜效果的影响

张玉笑 ，马阳历，郭衍银*，陈勇，刘莎莎，员丽苹，张新华，高霞，李彤

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255049；2.山东省农业技术推广总站，山东济南 250100；3.山东七河生物科技股份有限公司，山东淄博 255100）

香菇（Lentinus edodes）是世界上第二大栽培食用菌，味道鲜美，营养丰富，含有多种生物活性物质，如多糖、维生素、麦角甾醇、叶酸、矿物质、膳食纤维等，具有药食同源的特点，被誉为“菇中之王”[1-3]。但新鲜香菇含水量极高，代谢旺盛，又无表皮保护组织，采后常出现褐变、腐烂、软化、开伞和异味等不良现象，常温下仅能贮藏1～2 d[4]。

低温贮藏结合气调保鲜是一种极为有效的食用菌保鲜方法，通过控制贮藏环境的温度、气体成分及比例来维持产品品质，延长其贮藏期[5]。研究发现，低O2、高CO2能抑制呼吸速率及代谢活动，维持产品品质[6-7]。但由于香菇的呼吸速率远高于其他果蔬[8]，环境中的O2很容易在短时间内被消耗完，生成的高浓度CO2则会使香菇出现CO2伤害、异味等现象[9]；同时低O2环境容易引发香菇采后微生物腐烂[10]。而高氧、高二氧化碳自发气调（AMAP）的提出则巧妙地解决了这一问题，通过高O2与高CO2的联合作用，高O2缓解了CO2伤害和无氧呼吸产生的异味[11]，该技术在西兰花[12]、生姜[13]保鲜方面取得了很好的效果，也有研究表明80%O2+20%CO2处理能显著抑制细菌、霉菌的生长[14-15]。本试验通过向密闭容器内充入不同浓度配比的O2/CO2，研究了O2/CO2AMAP 对香菇采后的保鲜效果，以便寻找适宜的O2/CO2比例，为O2/CO2AMAP在香菇保鲜中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇自山东省淄博市淄川区七河生物科技有限公司购买，上午（气温平均在10～12 ℃）采摘后在1 h 内冷链运送至山东理工大学，置于（4±1）℃、相对湿度90%的冷库预冷24 h 后，选取菌盖直径5～6 cm、颜色黄褐、无机械伤、无病虫害、菌褶完整且均一的香菇进行试验。

茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，上海展云化工试剂有限公司；考马斯亮蓝、偏磷酸、甲醇、福林酚，天津致远化学药剂有限公司；碳酸钠、没食子酸、邻苯二酚，天津市凯通化学试剂有限公司；硫代巴比妥酸、氯化钠、磷酸、三氯乙酸、95%乙醇、无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1750 紫外可见分光光度计，岛津国际贸易有限公司；MR-07825-00 O2/CO2测定仪，美国FBI Dansensor公司；DDS-307A 电导率仪，上海精科雷磁仪器；DHG-9070A 型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；TA-XT Plus 型质构仪，英国stablemicrosystems 公司；HL-2136 色差仪，上海瑞戈实业有限公司；pHS-3C pH 计，合肥恒龙仪器仪表有限公司；GL-20G-2 台式高速冷冻离心机，上海安亭仪器制造厂；LC-3000N 超声波细胞破碎仪，上海联鲸电子科技有限公司。

1.3 试验设计

将挑选后的香菇分成5 组装入气调箱（302.9 mm×243.8 mm×243.8 mm），每箱装入3.8 kg 左右香菇、15 袋干燥剂（6 g/袋）和4 袋乙烯脱除剂（10 g/袋），并分别置换充入70% O2+30% CO2（处理1）、80% O2+20% CO2（处理2）、90%O2+10%CO2（处理3）、100%（处理4）和空气（CK），充入气体体积约为香菇体积的3 倍。每组设置3个平行，共15 个气调箱，于（4±1）℃下贮藏18 d，每3 d取样一次，测定相关指标。当香菇出现严重褐变、软化或异味后，即判定为失去商品价值，终止贮藏[16]。

1.4 指标测定

1.4.1 O2、CO2浓度、呼吸速率

使用O2/CO2测定仪测定气调箱内顶空气体。用O2/CO2测定仪测取样前气调箱3 h 内CO2含量的变化，单位为mg/(kg·h)。

1.4.2 失重率

失重率为香菇气调处理前后质量的比值，以%表示。

1.4.3 白度（L*）

参照Xu 等[17]的方法。随机取6 个香菇，用色差计测定香菇菌盖边缘3 个等距点的L*值。

1.4.4 相对电导率

参照Li 等[18]的方法。用直径6mm的打孔器随机取2 g香菇菌盖，加25mL蒸馏水，用电导率仪测其电导率（P0）；25℃保温1 h 后测其电导率（P1）；沸水浴30 min，再冷却至25 ℃后测其电导率（P2）。相对电导率计算公式见式（1）。

1.4.5 丙二醛（MDA）

参照Hu 等[19]的方法，取1 g 香菇菌盖，5 mL TCA 研磨，5 000 r/min 离心15 min 后，吸取2 mL 上清液，置于10 mL 离心管中，再加入2 mL TBA 和2 mL 蒸馏水，沸水浴15 min 显色，自然冷却于5 000 r/min 离心10 min，并在600、532、450 nm 波长下测定其吸光度。

1.4.6 总酚

参照Li 等[18]的方法。取2 g 香菇菌盖，10 mL 95%甲醇冰浴研磨后，20 ℃下超声波破壁1 h，10 000 r/min 低温离心25min 后，提取上清液；然后向滤渣中再次加入10 mL 95%甲醇，重复上述步骤，将两次上清液混合。取0.4 mL上清液，加入2 mL福林酚试剂（现配现用），避光反应5 min后，再加入1.6 mL 7.5%碳酸钠溶液，暗处放置1 h 后在765 nm 波长下测定其吸光度。总酚含量用没食子酸标准曲线定量表示为干物质质量（mg GAE/g）。

1.4.7 多酚氧化酶（PPO）

参照WANG等[20]的方法。取1g香菇菌盖，5mL0.1mol/L、pH7.0 磷酸盐缓冲液冰浴研磨，12000r/min 低温离心20min后提取上清液备用。反应液制备：1.95 mL0.1 moL/L、pH7.0磷酸盐缓冲液+0.5 mL、0.7 moL/L 邻苯二酚。向反应液中加入50 μL 上清液，摇匀后立刻用紫外-可见分光光度计在410 nm 波长下测定其3 min 内的吸光值变化。1 个酶活单位（U）定义为每分钟内使吸光值改变0.001 所需要的酶量。

1.4.8 乙醇和乙醛

参照徐呈祥等[21]的方法，采用静态顶空气相色谱法进行测定。设备参数：色谱柱为DM-FFAP（30 m×0.53 mm×1.5 μm）；升温程序：40 ℃维持2 min，以2 ℃/min 的速度加热至50 ℃后，以3 ℃/min 的速度升温至100 ℃并维持2 min；以He 为载气；流速为1.5 mL/min，进样量为1 mL；分流比为10:1；进样口与检测器温度分别为180 ℃和220 ℃。

1.4.9 感官评价

本研究从消费者角度选择了衡量香菇感官品质的指标，包括菌褶均匀度、菌盖均匀度、硬度、菌盖是否有暗斑以及染菌率。香菇从气调箱中取出后，在室温下转移至密封、无异味的塑料小桶，并在1 h 内由经过专业培训的10人感官评价小组对除染菌率以外的其他指标进行评分，评分标准见表1。评估后，将香菇在25 ℃下敞口放置3 d后，统计出现采后微生物病害的香菇数量，将其与总量的比值记为染菌率。

表1 香菇感官品质评分标准Table 1 Sensory scores standard of shiitake mushrooms

1.5 数据处理

所得数据用SPSS 19.0 软件进行LSD 显著性分析及相关性分析（P＜0.05），并用Excel 软件作图。

2 结果与分析

2.1 O2/CO2 AMAP 对气调箱内CO2、O2 浓度和香菇呼吸速率的影响

由图1A、B 所示，各处理的CO2浓度在贮藏前期迅速升高，之后进入平衡期，而O2浓度的变化趋势与其相反。处理1 贮藏6 d 后达到平衡期，此时CO2浓度达75.3%，显著高于其他处理（P＜0.05）；处理2、3、4 贮藏9 d后达到平衡期（70%～75%CO2和25%～30%O2）；CK 处理O2含量迅速降低，第3 d 时仅有1.8%，表明此时气调箱内的O2已经基本被香菇通过有氧呼吸转化成CO2。

如图1C 所示，各处理香菇的呼吸速率在初期急剧下降，处理1 在贮藏12 d 达到呼吸高峰，呼吸速率为19.8 mg/(kg·h)，而处理2、3、4 在15 d 才达到呼吸高峰，呼吸速率分别为18.6、13.2、14.4 mg/(kg·h)，这表明适宜比例的O2/CO2气体对香菇呼吸速率有一定的抑制效果，能够推迟呼吸高峰的出现。CK 则没有出现呼吸高峰，这可能与其产生的高CO2和过低O2有关。

2.2 O2/CO2 AMAP 对香菇失重率的影响

失重率随贮藏时间的延长呈增加趋势（图2）。处理3和处理4 在12 d 后失重率增速减缓，18 d 时分别为1.84%和1.87%，均低于CK 和处理1 在15 d 的失重率2.26%和2.34%，说明适宜比例的O2/CO2AMAP 能显著抑制香菇质量的降低（P＜0.05）。这可能与贮藏环境中高CO2导致的低呼吸强度以及高相对湿度引起的低水分散失有关。另外，CK 处理在15 d 后，由于香菇已经出现严重褐变和异味，失去商品价值，故终止取样。

2.3 O2/CO2 AMAP 对香菇白度（L*值）的影响

香菇的褐变通常被认为是失水、微生物活动和以PPO 为主的氧化作用的结果[22]。随着贮藏时间的延长，各处理的L*值逐渐降低（图3）。其中，CK 和处理1 的L*值下降速度最快，与处理2、3、4 之间均差异显著（P＜0.05）。贮藏15 d 时，CK、处理1、处理2、处理3 和处理4 白度的平均值分别为38.08、37.87、42.33、44.87 和42.99，表明处理3 能够较好地维持香菇的L*值。

2.4 O2/CO2 AMAP 对相对电导率和MDA 含量的影响

相对电导率的大小反映了细胞膜的完整程度，膜透性的增加会使PPO 等氧化酶与酚类物质接触，进而导致褐变的发生。如图4A（见下页）所示，各处理的相对电导率随贮藏时间的延长呈上升趋势。处理3 的相对电导率最低，其次为处理4，处理1 最高，CK 与处理2 差异不显著（P＞0.05）。这可能是因为高CO2对细胞膜造成的损伤，使得CK、处理1 和处理2 相对电导率较高，而对于其他处理，适宜比例的高O2在一定程度上缓解了CO2伤害。各处理香菇L*值的降低趋势也证实了这一点。

MDA 是膜脂过氧化反应的产物，其含量的积累会对细胞膜造成损伤，加速细胞老化。在整个贮藏期内，各气调处理的MDA 基本呈增加趋势（图4B）。CK 处理的MDA 含量显著高于其他处理（P＜0.05）；处理3 和处理4的MDA 含量一直维持在较低水平。

2.5 O2/CO2 AMAP 对总酚含量和PPO 活性的影响

酚类物质是香菇中天然的抗氧化成分，其含量与香菇褐变密切相关[23]。如图5A 所示，总酚含量在第3 d 稍有下降，然后迅速上升。第3 d 总酚含量的降低可能是高O2的存在促进酚类物质氧化所致。3 d 后，CK、处理1、处理2、处理3 和处理4 的总酚含量分别增加了30.8%、93.4%、108.2%、142.9%和123.9%，这可能是高CO2胁迫产生的活性氧作为信号因子激活了香菇体内的初级代谢和次级代谢，促进了酚类物质的合成所致[24]。

PPO 是引起香菇褐变的关键酶[23]。在整个贮藏期间，各处理PPO 活性在初期迅速降低，9 d 后趋于稳定（图5B）。其中CK处理的PPO活性一直处于最高水平，处理3、4在贮藏后期显著低于其他处理（P＜0.05）。18d 时，处理3、4 的PPO活性仅为入贮时的13.3%和16.7%。

2.6 O2/CO2 AMAP 对香菇乙醇和乙醛含量的影响

在整个贮藏期内，各处理的乙醇含量呈先升高后降低的趋势（图6A）。CK、处理2 和处理4 在9 d 达到峰值，分别为652、504、456 mg/kg；而处理1 和处理3 在12 d 达到峰值，分别为763、286 mg/kg，处理1 的峰值显著高于其他处理（P＜0.05）。另外，处理3、4 在6 d 前乙醇含量增加缓慢，说明香菇在贮藏初期的无氧呼吸并不严重；但CK处理在3d 时乙醇含量比入贮时增加306.7%，这与气调箱内O2耗尽导致香菇出现无氧呼吸的结论一致（图1A）。

各处理乙醛含量随贮藏时间的延长呈增加趋势（图6B）。其中，CK 和处理1 的增速最快，15 d 时达到233、184 mg/kg；处理2、处理3 和处理4 的增速较慢，15 d 时含量分别为110、93、103 mg/kg。与乙醇含量变化趋势类似，处理3 和处理4 在9 d 前乙醛含量增加缓慢。9～15 d内，各处理的乙醛含量迅速增加，而乙醇含量达到峰值后开始下降，这可能是因乙醇经乙醇脱氢酶（ADH）反向催化生成乙醛所致[25]。

2.7 O2/CO2 AMAP 对香菇感官品质的影响

如表2（见下页）所示，香菇的菌褶均匀性、菌盖均匀性、暗斑、硬度和染菌率均随贮藏时间的延长出现显著性差异（P＜0.05），验证了这些指标用来评价香菇感官品质的有效性。CK 和处理1 贮藏6 d 后，其硬度迅速下降，暗斑增加，12 d 时菌盖均匀度分别为4.98 分和5.15 分，而处理2、处理3 和处理4 直至贮藏末期都没有劣变至这个强度。处理2 对均匀度的维持效果较好，但是对延缓硬度降低及暗斑出现的能力较弱；处理3 对感官品质退化的抑制效果最好，但与处理4 并无显著性差异（P＞0.05）。CK、处理1 和处理2 在12 d 内抑菌效果逐渐增强，但随后染菌率升高（多为白色霉菌），这可能是因为后期香菇品质劣变，细胞膜等结构出现严重损伤，使霉菌等致病菌迅速大量繁殖，从而出现霉菌病害。而处理3 和处理4 的抑菌效果与其它处理均有显著性差异（P＜0.05），说明合适比例的O2/CO2AMAP 在处理期间与后续贮藏过程中均有很好的抑菌效果。

3 讨论

自发气调由于是一个密闭环境，不存在内外气体的交换[26]，因此气调箱内充入初始气体的成分和比例与香菇呼吸消耗O2生成CO2过程密切相关。本研究中，处理2、3、4 在贮藏9 d 后气调箱内气体成分达到70%～75%CO2、25%～30%O2的平衡状态，可能正是这种平衡的形成和维持较好地控制了香菇的代谢活动及后熟衰老的出现，使其品质显著优于CK 和处理1。此时的CO2浓度比CK 处理高30%左右，但其相对电导率和MDA 含量反而低于CK，进一步说明了高O2在一定程度上可以缓解CO2对细胞膜带来的伤害[12]。

Benito-Román 等[27]和Li 等[28]的研究表明，高压CO2可能通过改变PPO 的三级结构或干扰PPO 的疏水活性位点使其失活。高压的目的主要是使CO2转化成超流体状态，以增加其在水溶液中的溶解度。本研究中，CO2浓度在贮藏中期达到80%左右，香菇直接暴露在高CO2环境中，使PPO 活性在贮藏期间持续降低，至贮藏后期近乎失活。与上述结论一致，这也使得香菇内生成的酚类物质不会因PPO 氧化而损失[29]，进而有效抑制香菇褐变[30]。蘑菇抗氧化能力大小主要取决于酚类物质的含量，抗氧化能力的增强提高了香菇对活性氧、自由基等的清除能力，进而降低了细胞膜受到的氧化损伤，延缓了MDA 和相对电导率的升高，维护了细胞膜的完整性[31]。此外，气调环境的高湿度和强抑菌能力，避免了因失水和微生物侵染而导致的褐变出现[32]。因此适宜初始比例的O2/CO2AMAP能很好地维持香菇的L*值。

香菇含水量一般在85%～95%，天然的高水分含量为微生物提供了理想的环境，且香菇栽培多依赖堆肥，受到微生物侵染的可能性极高，大量微生物的存在使香菇出现褐变、斑点和腐烂等现象[33-34]。适宜的AMAP 气调是对香菇细胞膜完整性的保护，提高了香菇的抑菌能力。刘莎莎等[14]和Hoogerwerf 等[15]的研究表明，合适比例的O2/CO2AMAP 可通过活性氧伤害抑制体外致病菌活性，且效果随CO2浓度的增加而增强。由于果蔬呼吸产生的高CO2，本试验结果进一步证实了O2/CO2AMAP 在活体内对致病菌同样具有抑制能力。

表2 O2/CO2 AMAP 对香菇感官品质的影响（分）Table 2 Effects of O2/CO2 AMAP on sensory quality of mushrooms during storage(score)

适宜比例的AMAP 可能通过抑制无氧呼吸途径中关键酶的活性降低乙醇、乙醛的产生，既缓解了高CO2带来的异味等不良影响，又减少了乙醇、乙醛对细胞膜产生的损伤，维护了细胞膜的完整性，这正是处理3 和处理4 能够在整个贮藏期间维持香菇硬度的原因。同时，Tian 等[35]研究表明，高O2的条件下适量乙醇在ADH 反向催化生成乙醛有益于香菇品质的维持，这同样可能是高O2缓解CO2伤害的一个重要途径。

4 结论

综上所述，适宜比例的O2/CO2AMAP 可以抑制香菇的呼吸，增加总酚含量，抑制PPO 的活性，以及MDA 和相对电导率的增加，维持细胞膜的完整性，从而延缓了褐变和软化，并显著降低了采后病害的发生；而不适宜的O2/CO2AMAP 比例，如处理1，反而加速了香菇软化、褐变、异味和后熟的出现，缩短了香菇的贮藏期。本试验条件下，处理3（90%O2＋10%CO2）具有最好的保鲜效果和抑菌能力。