大麦条纹病病菌对大麦叶片防御酶活性的影响

郭 铭，孙莉莎，司二静，姚立蓉，汪军成，李葆春，杨 轲，孟亚雄，马小乐，王化俊

(1. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070；2. 甘肃农业大学 农学院，兰州 730070；3. 甘肃农业大学 生命科学技术学院，兰州 730070)

大麦(HordeumvulgareL.)是种植最早的农作物之一，大约有5000多年的种植历史，与小麦相比，大麦有较强的适应能力和耐逆性[1]。大麦主要应用于饲料、食粮、酿酒等方面，种植面积仅次于小麦、水稻和玉米而位居第四[2]。大麦病害的普遍发生一方面阻碍了其产业的发展，另一方面使其产量和品质均严重下降[3]。大麦条纹病(Barleystripe)是大麦的主要病害之一，该病原菌有性态病菌为麦类核腔菌(PyrenophoragramineaIto et Kuribayashi)，无性态病菌为禾内脐蠕孢[Drechsleragraminea(Rabenh)Shoemaker][4]。大麦条纹病主要危害植物的叶片、叶鞘和茎秆部位，主要通过种子带菌传播[5]，在北欧和地中海地区发生比较严重，在中国主要发生在江苏、上海、浙江、四川以及甘肃河西走廊等地[6]。近年来，通过种子包衣、药剂防治、改善农田环境和土壤结构等均能有效地防治大麦条纹病，但种子包衣技术在甘肃、青海和西藏等大麦种植区域还未能有效地应用[7]。

活性氧(Reactive oxygen species，ROS)一直被认为是有氧代谢的有毒副产物，植物在受到病菌侵染后，ROS量急剧增加，进而影响脂质、蛋白质以及核酸的功能[8]。另外，一些防御酶如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)以及其他酶类活性均有明显的变化，但是植物本身可以通过增强酶的活性来提高其抵抗逆境的能力，并维持其存活[9-11]。陈捷等[12]发现接种玉米弯孢病病菌毒素后，抗病品种的PAL和POD活性增加快于感病品种。王桂清等[13]研究发现灰斑病病菌侵染玉米20d后，抗、感品种的CAT活性均降低，POD活性均升高，并且感病品种的酶活性高于抗病品种。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)与游离的脯氨酸(Proline)可作为重要的渗透调节物质，在植物遭受胁迫时通过在细胞内积累这些物质，来维持细胞膜两侧的渗透势平衡，从而达到抵抗逆境胁迫的目的[14]。林仁辉[15]研究表明，镁显著影响小白菜生物量的积累，镁离子缺乏使小白菜叶绿素含量下降并产生大量活性氧引起MDA的积累，适量施用镁肥可以显著提高光合作用及SOD、POD的活性。目前，有关病菌侵染植物后其防御酶活性的变化也有相关报道[16-20]，但是，对于条纹病病菌与大麦的互作机制缺乏系统研究，对大麦条纹病发生后对大麦防御酶的影响鲜见报道，因此，本研究以对条纹病病菌表现高感的大麦品种Alexis为研究材料，研究条纹病病菌侵染后对大麦防御酶的变化，以期为大麦的抗条纹病机理和抗病育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大麦品种Alexis和大麦条纹病病菌菌株QWC[21]均由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室/甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类种质创新课题组提供。

1.2 试验设计

试验主要采用“三明治法”进行人工接种[22]。将高感品种Alexis的20粒种子经φ=70%的酒精处理30 s后，再用φ=5%的次氯酸钠溶液处理5 min，用无菌水清洗4～5次后晾干2.5～3 h，将种子摆放在长满菌丝的PDA培养基上，用另一长满菌丝的PDA培养基的皿覆盖在种子上，置于6 ℃冰箱中保存至种子萌发(约20 d)，密封后，放置在22 ℃，无光照的条件下继续培养7～14 d。试验设3次重复。

将土、沙、蛭石按体积比3∶1∶1混合均匀，作为大麦生长培养基质，经高压蒸汽灭菌 (121 ℃，30 min)后备用。将萌发的种子移栽至直径为9 cm的花盆中，待其生长至三叶期时，分别采集第3天、第6天、第9天和第12天的大麦叶片，进行相应生理指标的测定。

1.3 生理指标的测定

1.3.1 超氧化物歧化酶活性 参照裴斌[23]的方法进行测定。反应体系为 3 mL，依次加入0.05 moL·L-1的磷酸缓冲液(pH=7.8)1.5 mL、 0.13 moL·L-1的甲硫氨酸(Met)溶液0.3 mL、 0.75 mmoL·L-1的氮蓝四唑(NBT)溶液0.3 mL、0.1 mmoL·L-1的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液0.3 mL、0.02 mmoL·L-1的核黄素0.3 mL、0.05 mL的酶液、0.25 mL 的蒸馏水，混合后将一支对照管置暗处，其余各管于4 000 lx日光下反应20 min，测定OD560，每个测定液重复3次，以抑制50%的酶活性为1个酶活单位(U)，结果表示为 U·g-1。

1.3.2 过氧化物酶活性 参照李合生[24]的方法进行测定。反应体系为 3 mL，向比色杯中加入0.10 mL的待测液(酶液)、φ=0.3%愈创木酚溶液2.6 mL，将比色杯放入比色槽，加φ=0.6% H2O2溶液，立即计时，启动反应，计时2 min后，测定OD470，每30 s测定1次，共测量4次，以OD470增加1为1个酶活单位(U)，结果表示为 U·g-1。

1.3.3 过氧化氢酶活性 参照陈利锋等[25]的方法进行测定。反应体系为 3 mL，配制H2O2溶液，用蒸馏水调零，向比色杯中加入0.2 mL的待测液(酶液)，将比色杯放入比色槽，加 0.067 moL·L-1H2O2溶液2.8 mL，立即计时，启动反应，计时2 min后，测定OD240，每1 min测定1次，共测量2次，以每分钟的OD240下降1为1个酶活单位(U)，结果表示为 U·g-1。

1.3.4 游离脯氨酸含量 参照王三根[26]的方法进行测定。吸取2 mL提取液移入带塞的玻璃试管中，加入2 mL冰醋酸及2 mL φ=2.5%酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热10 min，冷却后加入4 mL甲苯，摇荡30 s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3 000 r·min-1离心5 min，吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，测定OD520，含量单位为μg·g-1。

1.3.5 丙二醛含量 参照高俊凤[27]的方法进行测定。取大麦叶片0.5 g，加入φ=10%三氯乙酸溶液(含1% PVP，pH 7.0)4 mL充分研磨，于 4 ℃以3 000 r·min-1离心10 min。取上清液 2 mL加入等体积φ=0.6%硫代巴比妥溶液，沸水水浴15 min，冷却后以3 000 r·min-1离心10 min，利用紫外分光光度计(U-5100UV/VIS)超微量光度计测定各处理在OD532、OD600和OD450，计算丙二醛(MDA)含量。

1.3.6 叶绿素相对含量 利用叶绿素仪(SPAD-502PLUS，KONICA MINOLTA)测定叶片叶绿素相对含量[28]。分别选择生长一致的大麦5株，对每一株大麦叶片取相同部位进行叶绿素相对含量的测定，最后取均值，得出总体叶绿素相对含量(SPAD)。

1.4 发病统计和数据分析

幼苗成长至三叶期后，分别在第3天、第6天、第9天、第12天对大麦品种Alexis进行病情调查，调查20 株，每株按0、1、2、3、4、5等级进行分级统计[29]，并计算病情指数。

调查分级标准为：0级，不发病；1级，植株上有零星病斑；2级，整株的发病率为小于15.00%；3级，整株的发病率为15.00%～30.00%；4级，整株的发病率为30.00%～50.00%；5级，整株的发病率为50.00%以上。

病情指数(Disease index,DI)计算公式为：

DI=∑(发病级别×各级病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)×100

2 结果与分析

2.1 感病品种Alexis的发病情况

经过对不同时间大麦条纹病发生情况的调查结果表明(表1)，感病品种Alexis接菌之后，病株率和病情指数随着条纹病病菌株QWC侵染时间的延长而逐渐增加，且大麦条纹病病情指数为 5.00～19.72，发病率为15.00%～70.00%，表明种子带菌是大麦条纹病的主要初侵染源。在第3天(三叶期)时病株率和病情指数最低，分别为 15.00%、5.00；到第12天时，病株率和病情指数达到最大值，分别为70.00%、19.72。

表1 大麦品种Alexis接种大麦条纹病病菌菌株QWC后不同时间的发病结果

图1可以看出，将浸菌后培养20 d(22 ℃，黑暗)的大麦种子(图1-A)移栽到盆中，在第3天时(三叶期)，叶片上刚出现浅黄色斑点或短小的条纹，随着接菌时间的延长，从叶片基部到叶尖形成平行于叶脉的细长条斑，而后转为深褐色条斑，且病斑周围也会褪绿变黄(图1-B)。

2.2 条纹病病菌侵染对大麦叶片酶活性的影响

随着接种后时间的延长，对照组Alexis品种叶片SOD活性变化不明显，整体呈上升趋势，接菌处理后，大麦品种Alexis叶片SOD活性显著升高，呈先上升后下降的趋势，分别较各自对照显著增加7.86%、49.67%、41.17%和11.63%，平均增幅为27.58%。接菌第3天～第6天时，大麦品种Alexis叶片SOD活性迅速增加，第6天～第9天时上升缓慢，在第9天时达到峰值，且差异显著(图2-A)。虽然对照组Alexis品种叶片POD活性在第9天时略微下降，但整体变化不明显，接菌处理后，大麦品种Alexis叶片POD活性较对照的均有所增加，呈先下降后上升的趋势，平均增幅为39.38%(P<0.05)。接菌第6天时，POD活性略微下降，而在第9天、第12天时，POD活性分别较各自对照差异显著(图2-B)。对照组Alexis品种叶片CAT活性变化不明显，接菌处理第3天～第9天时，CAT活性分别较各自对照有明显的升高趋势，平均增幅为32.71%。在第9天时增幅达到最高，为77.43%，且与对照组差异显著，而在第12天时CAT活性与对照的差异不显著(图2-C)。

2.3 大麦条纹病病菌侵染对大麦叶片的脯氨酸和丙二醛含量的影响

随着接种后时间的延长，对照组Alexis品种叶片脯氨酸含量呈先上升后下降的趋势，接菌处理后，大麦品种Alexis叶片脯氨酸含量与对照组差异显著(P<0.05)，整体呈先上升后下降的趋势，分别较各自对照增加40.90%、44.22%、 114.88%和82.21%，平均增幅为70.55%。在第3天～第9天时脯氨酸含量持续上升，且在第9天时达到最大，增幅为 114.88%，随后逐渐降低(图3-A)。接菌处理后，大麦品种Alexis叶片MDA含量分别较各自对照下降 17.90%、14.93%、9.24%和2.76%，平均降幅为11.21%。在第3天MDA含量降幅最大，且与对照组差异显著 (P<0.05)，而第12天MDA含量与对照组无差异显著，其原因可能是MDA对大麦条纹病病菌起负调控的作用(图3-B)。

2.4 大麦条纹病病菌侵染对大麦叶片叶绿素相对含量的影响

随着接种后时间的延长，对照组Alexis品种叶片中叶绿素相对含量无明显变化，接菌处理后，SPAD值与对照组差异显著，分别较各自对照下降12.31%、36.82%、52.09%和84.34%(P< 0.05)，平均降幅为46.39%。第3天时，SPAD值下降不明显，第6天～第12天下降显著，至第12天时SPAD值降至最低，相比对照组低 84.34%(图4)。

3 讨 论

当外界病原物侵染植株后，植物体为防御因毒害造成的氧化胁迫，其自身有一套完整的清除酶系统。在植物体受到逆境胁迫时ROS会迅速富集，同时也会对植物造成毒害，且发生不同程度的变化。其中SOD、POD和CAT等能够作为防御酶系统来保护自身的损伤，且这几类酶对保护机体免受活性氧和氧自由基的伤害起着至关重要的作用[30]。赵欣等[31]通过解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株HRH317处理玉米植株后再接种串珠镰孢(Fusariummonilifome)，发现玉米体内与抗逆相关的酶CAT、POD和SOD活性升高。连玲丽等[32]通过短小芽孢杆菌(B.pumilus)菌株EN16诱导番茄叶片，发现菌株EN16能增强番茄植株中SOD、POD和CAT等防御酶的活性。向妙莲等[33]研究表明茉莉酸甲酯(MeJA)能诱导水稻幼苗对白叶枯病的抗性，且诱导抗性的产生与 MeJA 提高水稻相关防御酶的活性有关。陈亮等[34]研究表明西瓜枯萎病病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)接种处理后，3个西瓜品种叶片的SOD、POD、PPO、PAL、CAT 活性较未接种对照的均显著提高。本试验中，大麦感病品种Alexis受到大麦条纹病病菌侵染后，相比对照而言，SOD、POD和CAT活性从第3天开始均呈增加趋势，整体而言，SOD和POD活性都呈先上升后下降的趋势。另外，随着病菌侵染时间的增加，SOD和POD活性均有一段下降趋势，可能由于当SOD防御系统不能满足植物体需要时，POD同时也进行防御，这与徐品三等[35]对百合无症病毒对其酶活性的影响研究结果相一致。房保海等[36]在研究烟草接种低头黑病病菌毒素后也得到相似的结论。CAT活性呈先上升后下降的趋势，且在第9天时达到最大，表明大麦感病品种Alexis在感病后，起初体内CAT的活性增强，这种变化可能无法清除持续产生的过氧化氢(H2O2)，从而使得H2O2逐渐地累积，引起植株体内H2O2代谢失衡，CAT活性不断下降，这与吴秋桢等[37]对文心兰接种软腐病菌后其体内防御酶活性的变化相 一致。

植物在受到逆境胁迫时，首先受害的是细胞膜系统，该过程主要是过氧化作用的主要产物MDA含量明显增加，质膜透性(Plasma permeability，PMP)增大，导致离子外渗。对于这种非生物胁迫的应答机制，植物体自身通过一系列的代谢反应大量地积累一些有机小分子化合物和多肽类物质(如脯氨酸)来降低原生质水势，调节细胞膜两侧渗透势的平衡，从而有效地调节植物体内生理代谢的紊乱[38]。在植物受到逆境胁迫时，往往会发生膜脂过氧化作用，MDA就是其产物之一，其含量的高低可作为逆境胁迫的重要指标之一。另外，在植物体内，脯氨酸是组成蛋白质的成分之一。脯氨酸、可溶性糖这些渗透性物质在植物受到非生物胁迫时能够发挥作用以保证细胞正常的生理功能[39]。王彩霞等[40]研究表明腐烂病病菌侵染对苹果愈伤组织后，感病品种MDA含量上升速度快，但均低于对照。董丽红等[41]研究表明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株 NCD-2侵染棉花品种‘冀棉11’后，L-脯氨酸可以显著提高菌株生物膜形成能力。本试验中，大麦感病品种 Alexis受到大麦条纹病病菌侵染后，MDA含量较对照均呈下降趋势，这可能是大麦条纹病病菌侵染植株后使得细胞膜体系遭到破坏，从而紊乱植物细胞的生化平衡，但随着侵染时间的增加，MDA含量逐渐增加，是由于活性氧自由基的积累超过过氧化物酶系统的清除能力，从而导致过氧化物酶系统的伤害，继而导致膜脂过氧化作用的进一步加强，MDA含量也随之增加，病害加重，这与孟璐璐等[42]通过对苹果接种灰霉病病菌(Botrytiscinerea)后MDA变化的结果相一致。接菌后，脯氨酸含量较对照都呈上升的趋势，随着时间的延长，整体呈先上升后下降的趋势，这与周丽等[43]的研究结果相似。

植物叶绿素含量的高低是评估其光合作用的指标之一，当植株受到逆境胁迫时，主要表现为光合作用的降低，使得叶绿素含量降低[44]。本试验中，随着接菌时间的增加，大麦感病品种Alexis的叶绿素含量逐渐降低，并且时间越长，其降幅越大，这主要是在接菌后严重阻碍了大麦叶片的延伸，使得光合器官的生理功能被破坏，这与尹启琳等[45]通过PEG胁迫处理小麦品种后其体内叶绿素相对含量的变化结果相一致。

综上所述，大麦感病品种Alexis受到大麦条纹病病菌侵染后，叶片细胞膜系统受到不同程度的损坏，导致叶片内MDA和Pro含量上升。此外，细胞结构被破坏，光合作用受到抑制，体内叶绿素分解酶的活性逐渐升高，使叶绿素转变成叶绿素醇和叶绿素脂，从而使得叶绿素相对含量降低。植株体内的抗氧化防御酶也发生了变化，SOD、POD和CAT活性显著升高，并且都呈先上升后下降的趋势。大麦接种大麦条纹病病菌后防御酶活性发生变化，这些防御酶的基因表达量的变化是否与酶活性的变化相一致有待于进一步研究。此外，在条纹病胁迫下大麦叶片在生理生化指标上表现为多方面的综合防御，各因素之间如何协同有待深入研究。