红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

王丹丹，刘华栋，宋 林

(1.辽东学院 农学院，辽宁丹东 118003; 2.渭南市农业技术推广中心，陕西渭南 714000)

红花(Carthamustinctorius)为隶属于桔梗目(Campanulales)菊科(Asteraceae)红花属(CarthamusL.)的1a生草本植物，别名红蓝花、刺红花，喜温暖、干燥气候，抗寒性强，耐贫瘠。其干燥花富含羟基红花红色素A等黄酮类化合物，具有活血通经，散瘀止痛，散湿去肿的功效，是一种药油兼用的重要经济作物，在中国新疆、云南、四川及河南等地广泛种植[1]。

花青素(Anthocyan)，又称为花色素，是一种天然的水溶性色素，多存在于植物的花瓣、果实和叶片中，也是植物中的主要呈色物质。目前已知的花青素有20种，植物中常见的有6种，分别为芍药色素(Pn)、天竺葵色素(Pg)、飞燕草色素(Dp)、矢车菊色素(Cy)、牵牛花色素(Pt)和锦葵色素(Mv)。花青素存在于植物细胞的液泡中，根据液泡中溶液pH的不同，花青素的颜色也有所不同，如在酸性溶液中呈红色，在碱性溶液中呈蓝色，而在中性溶液中呈紫色，并且其颜色的深浅与花青素的含量呈正比关系[2-3]。自然界中游离的花青素极少见，通常一个花色基元与一个或多个单糖结合形成糖苷，以糖苷形式存在，又称为花色苷(Anthocyanin)。植物花青素的合成属于类黄酮合成途径的一个分支，在植物细胞质中，苯丙氨酸作为合成途径的直接前体，经过一系列的酶促反应最终转化成各种花青素。MYB转录因子是植物转录因子家族中最大的家族成员之一，广泛存在于植物中，参与植物的初生和次生代谢反应、植物细胞形态和模式建成等多个生长发育过程，对植物生长具有重要的调节作用。绝大多数MYB转录因子的DNA结合区高度保守，根据其DNA的结合区重复次数的不同，又分为1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB4个家族。其中R2R3-MYB转录因子对植物花青素的次生代谢调控有着重要的作用，在玉米、拟南芥、矮牵牛等植物中均得到深入研究[4-9]。ZmC1是植物中克隆的第1个R2R3-MYB基因，也是第1个被克隆的花青素合成调控因子，该转录因子能够调控玉米糊粉层花青素的生物合成[10]。在拟南芥的研究中发现，PAP1/AtMYB75、PAP2/AtMYB90的过量表达能够诱导花青素的大量积累，同时拟南芥的AtMYB11/PFG2、AtMYB12/PFG1、AtMYB111/PFG3能够参与调控类黄酮合成途径的上游生物合成基因群(early biosynthetic genes，EBGs)，激活CHS、CHI、F3H和FLS1的表达。葡萄VvMYBA1、VvMYBA2可以通过激活UFGT基因的启动子，进而提高花青素的合成积累，从草莓中分离出来的FaMYB1对烟草的过表达试验显示，FaMYB1可以直接抑制类黄酮生物合成途径下游基因(ANS)的表达，减少花青素的积累[11-16]。随着植物花青素代谢途径的深入研究，越来越多关于R2R3-MYB转录因子调控植物花青素代谢的机制被发现，如苹果MdMYB10能够协同苹果MdbHLH3(bHLH类转录因子)，提高MdDFR基因的表达，在果实成熟的过程中诱导苹果果皮生成红色花青素。在拟南芥中，类黄酮代谢途径还可以通过MYB、bHLH、WD40转录因子相互作用，形成一个三联复合体(MYB-bHLH-WD40)进行调控[17-18]。

迄今，对红花CtMYB-TF1基因的研究鲜有报道，基于学者们的研究成果，本试验以红花花瓣为试验材料，提取红花总RNA，通过搜索红花基因转录组数据库相关EST序列片段，结合拟南芥模式植物的MYB转录因子家族数据库进行反复筛选，利用NCBI上的Blast功能在线设计特异性克隆引物，以RACE和RT-PCR技术扩增获取CtMYB-TF1基因序列全长，采用在线生物信息学软件预测CtMYB-TF1基因序列的氨基酸结构以及蛋白质的理化特性，同时构建氨基酸序列同源性系统进化树，并分析红花MYB-TF1基因在红花花青素等类黄酮代谢物合成调控中的作用，为进一步研究红花MYB-TF1基因过表达对提高红花花青素的含量问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用红花品种为AC-1无刺红，种子采购于安国中药材推广站，2019年3月21日种植于辽东学院农学院，经分子鉴定，确定为红花(Carthamustinctorius)。于2019年7月20日选取长势良好、花色稳定的植株，采集开花盛期的花瓣作为试验材料，置于-80度冻存，待用[19]。

1.2 总RNA提取

称取50 g红花花期1 d、3 d、5 d和7 d花瓣组织研磨成均匀粉末，置于1.5 mL离心管中，按照RNA提取试剂盒(Total RNA Extractor Trizol)说明书提取红花总RNA，并检测红花总RNA的完整性[20-21]。按照Takara反转录试剂盒说明书步骤，以提取的高质量红花总RNA为模板，引物为CtMYB-R1(表1)，按照一步法 RT-PCR扩增试剂盒(M-MuLV One-step RT-PCR Kit)说明书生成cDNA第1链，-20 ℃保存，作为红花CtMYB-TF1基因核心序列克隆的模板。

1.3 CtMYB-TF1基因核心序列的克隆

以拟南芥(Arabidopsisthaliana)的AtMYB-TF1基因序列(GenBank登录号为CB074560.1)设计引物(表1)。模板为红花CtMYB-TF1基因新合成的第1链cDNA，引物为MYB-coreF/MYB-coreR，克隆红花CtMYB-TF1基因的核心序列。反应体系20 μL，即0.8 μL cDNA，0.5 μL dNTP Mix，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，0.8 μL Advantage○R2 聚合酶混合液 (50×)，2 μL Advantage○R2 PCR 缓冲液 (10×)，灭菌ddH2O 加至20 μL；PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸6 min。将PCR扩增的目的片段克隆到pUCm-T载体，并转化大肠杆菌感受体细胞TOP10[22]。选择阳性转化子送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 引物信息

1.4 红花 CtMYB-TF1基因RACE扩增

根据CtMYB-TF1核心片段设计CtMYB1-F1/ CtMYB1-F2特异性正向引物，分别与CtMYB1-R2反向引物组合进行2次巢式PCR，快速扩增红花CtMYB-TF1基因3′端序列[23-24]。扩增条件中退火温度：第1轮巢式PCR，65 ℃ 45 s；第2轮巢式PCR，60 ℃ 45 s；延伸时间：第1轮巢式PCR，72 ℃ 3 min；第2轮巢式PCR， 72 ℃ 5 min，其余反应条件均同“1.3”。根据CtMYB-TF1基因核心片段设计CtMYB2-R1、CtMYB2-R2和 CtMYB-R3特异性反向引物，分别与SMARTer RACE 快速扩增试剂盒中UPM引物组合进行3次巢式PCR，快速扩增红花CtMYB-TF1基因 5′端序列。步骤同“1.3”。

1.5 红花 CtMYB-TF1基因全长验证

为获得红花CtMYB-TF1基因全长cDNA片段，采用在线软件DNAStar拼接红花CtMYB-TF1基因的5′-末端片段、核心序列与3′-末端片段。以红花CtMYB-TF1基因全长cDNA为模板，以包含该基因开放阅读框(ORF)的CtMYB-F/CtMYB-R为引物，扩增红花CtMYB-TF1基因。

1.6 生物信息学分析

通过软件DNAMAN将CtMYB-TF1基因翻译成氨基酸序列；在线软件ORF Finder 查找CtMYB-TF1基因全长cDNA序列最大开放阅读框(ORF)，ExPASy-ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析红花CtMYB-TF1蛋白质的氨基酸序列与理化特性；采用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)分析红花CtMYB-TF1蛋白质三级结构，并在NCBI数据库采用在线Blast检索红花CtMYB-TF1蛋白质的同源蛋白，DNAMAN 5.0进行同源蛋白的氨基酸序列比对，并采用MEGA 7.0构建红花CtMYB-TF1蛋白质系统发育进化树(邻接法)[25]。

1.7 CtMYB-TF1基因和CtANS基因表达分析

检测红花CtMYB-TF1和红花花青素合成酶基因(CtANS)在不同花期中的表达情况，以18S为内参基因，采用Primer Premier 6软件设计引物18SF/18SR、CtMYB-qF/ CtMYB-qR和CtANS-qF/ CtANS-qR(表1)。建立10 μL荧光定量RT-qPCR反应体系：cDNA模板 1 μL，10 μmol ·L-1上下游引物各 0.5 μL，SYBR Green PCR Master mix 5 μL， ddH2O 3 μL；避光条件下将反应液分别加入96孔板，添加后弹去气泡，微孔板离心机离心2 min。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环；采用2-△△Ct法对红花CtMYB-TF1和CtANS基因进行相对定量表达分析，每个反应进行3次生物学重复[26]。

2 结果与分析

2.1 红花转录因子 CtMYB-TF1基因cDNA全长克隆

采用简并引物CtMYB-coreF/ CtMYB-coreR进行RT-PCR，扩增红花CtMYB-TF1基因核心序列，克隆得到约900 bp 的DNA片段(图1-A)，采用NCBI数据库中Blastx在线软件将红花CtMYB-TF1基因核心片段编码的氨基酸与多种植物的MYBs基因编码的氨基酸进行比对发现均具有85%～98%的相似性，验证克隆得到的cDNA片段为红花CtMYB-TF1基因的核心序列。基于红花CtMYB-TF1基因核心序列设计引物，分别进行5′-RACE与3′-RACE 末端快速扩增，分别得到约为1 300 bp 和1 000 bp的明亮条带(图1-B，1-C)，5′-RACE、核心序列与 3′-RACE采用DNAStar的SeqMan程序进行3段序列的拼接，获得红花CtMYB-TF1基因cDNA全长为1 260 bp 。采用ORF Finder分析红花CtMYB-TF1基因的cDNA片段为750 bp，采用包含CtMYB-TF1基因的开放阅读框(ORF)的引物CtMYB-F/CtMYB-R进行RT-PCR扩增验证，得到与预测大小一致的约750 bp 明亮目的片段(图1-D)。验证该片段包含完整的红花CtMYB-TF1基因的ORF，表明试验成功克隆得到红花CtMYB-TF1基因的全长cDNA序列，即CtMYB-TF1基因。

2.2 红花CtMYB-TF1蛋白质理化特性分析

CtMYB-TF1基因全长1 260 bp，cDNA为750 bp，编码249个氨基酸(图2)；5′非翻译区(5′ untranslated region,5′-UTR)长306 bp， 3′非翻译区(3′untranslated region,3′-UTR)长204 bp。ProtParam预测CtMYB-TF1蛋白质分子式为C1220H1930N358O378S13，分子质量为28.08 ku，理论等电点(pI)7.14，偏碱性；其编码蛋白的氨基酸组成中赖氨酸(Lys)和丝氨酸(Ser)的含量最高，各占9.2%，酪氨酸(Tyr)的含量最低，占0.8%；带正电荷的强碱性氨基酸残基(Arg+Lys)与带负电荷的强酸性氨基酸残基(Asp+Glu)均为37，说明该编码蛋白呈电中性；不稳定系数为52.04(52.04>40)，说明该编码蛋白质不稳定；脂肪指数为68.51，说明该编码蛋白属于一种中温型的生物蛋白；根据生物信息学软件expasy的protscale在线分析工具对红花CtMYB-TF1基因编码蛋白进行亲疏水性分析，结果显示，MIN：-2.721(Val/133)，MAX：0.532(Ser/87)。正值越大表示疏水性越强，负值越小表示亲水性越强，该编码蛋白序列仅在84～90区域具有明显疏水性，其余区域均为亲水性，并且在113～142区域有最强亲水性，因此预测该编码蛋白为亲水性蛋白(图3)。将红花CtMYB-TF1基因编码蛋白的氨基酸序列上传到生物信息学软件SOPMA进行二级和三级结构预测，可见红花CtMYB-TF1基因编码蛋白的三级结构主要是由一些α-螺旋、转角和大量的无规则卷曲构成，与二级结构预测结果相一致(图4，图5)。

为了更好地判断红花CtMYB-TF1与这些已知的类黄酮生物合成调节相关的R2R3-MYB转录因子之间的关系，在多序列比较的基础上进一步构建系统进化树，采用MEGA-X软件对这些序列以邻接法构建进化树，Bootstrap参数设置为1 000。结果显示，这12个不同的R2R3-MYB转录因子根据其在类黄酮生物合成途径中的不同功能分为3大类，即黄酮醇(Flavonol)、花青素/原花青素(Anthocyanin/proanthocyanidin)和花青素(Anthocyanin)。其中，红花CtMYB-TF1基因与调控花青素/原花青素的葡萄VvMYBPA1和亲缘关系较近(图6)。

2.3 红花 CtMYB-TF1基因的功能预测

通过生物信息学在线软件MEME扫描发现，红花CtMYB-TF1基因编码蛋白的氨基酸序列N末端存在1个SG5功能域的基序(DExWLRxxT)(图7)，推测红花CtMYB-TF1属于S5亚族，该亚族成员包括拟南芥AtMYB123和玉米ZmC1。

2.4 CtMYB-TF1基因和CtANS基因表达分析

采用qPCR技术分析红花CtMYB-TF1基因和花青素合成酶基因CtANS分别对红花花期 1 d、3 d、5 d和7 d花瓣中蛋白质表达量的调控，并分析红花CtMYB-TF1基因的表达对其CtANS基因表达量的影响。结果显示，18S RNA、CtMYB-TF1和CtANS基因3种基因编码的蛋白质产物特异性较强，并无荧光信号污染，如引物二聚体和非特异性产物等，对荧光定量qPCR扩增产物进行熔解曲线分析，发现各基因的扩增曲线峰值较为集中且单一，拟南芥18S RNA基因Tm值集中在82.5 ℃，红花CtMYB-TF1基因Tm值集中在81.5 ℃，红花CtANS基因Tm值集中在84.1 ℃。结果显示，以18S RNA的蛋白质相对表达量为标准，红花CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因，并且随着花期时间的延长红花CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高，其中在花期的第5天红花CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值(图8)。试验进行了3组生物学重复。

3 讨 论

探究花青素合成途径的调控一直以来都是研究的热点，目前，关于红花调控花青素的转录因子研究鲜有报道。因此，对红花CtMYB-TF1调控花青素含量的研究具有重要的理论和实际意义。红花调控花青素代谢CtMYB-TF1基因的克隆与序列分析，为进一步研究该基因在红花体内过表达时对花青素含量的影响奠定基础。

本试验以红花花瓣为研究对象，提取总RNA，通过NCBI在线设计特异性引物，以RT-PCR技术成功克隆一段MYB基因序列，将其命名为红花CtMYB-TF1。该基因编码序列长750 bp，共编码249个氨基酸，其蛋白质分子式为C1220H1930N358O378S13，分子质量为28.08 ku，是一种不稳定的碱性亲水蛋白；利用荧光定量qPCR技术对红花CtMYB-TF1基因和CtANS基因进行蛋白质表达量分析，可见红花CtMYB-TF1基因在花期的各个时段相对表达量均高于红花CtANS基因，并且随着花期时间的延长红花CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高，其中在花期的第5天红花CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值。CtMYB-TF1转录因子使红花花青素CtANS基因的表达呈明显上升状态，为采用分子生物学及基因工程手段构建高产的红花花青素细胞系提供了实践依据。

从邻接法构建的进化树来看，红花CtMYB-TF1与葡萄VvMYBPA1亲缘关系较近，同时在MEME扫描中发现红花CtMYB-TF1基因编码蛋白的氨基酸序列C末端存在拟南芥S5亚族的功能基序，说明红花CtMYB-TF1属于S5亚族，并且有可能参与花青素/原花青素的调控。此外，已知拟南芥AtMYB123能够与TT8进行协同作用，增强AtDFR基因的表达[26-27]，因此进一步推测红花CtMYB-TF1可能通过由PKC介导的信号转导途径进入细胞核内行使其调控花青素合成的生物学功能，该基因也能够与bHLH转录因子发生协同作用参与调控DFR基因的表达，进而影响到花青素的合成途径，提高花青素的含量。这一推测在同为桔梗目菊科植物的菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)当中得到验证，LIU等[27]从菊花中分离出的CmMYB6与CmbHLH2的协同效应有效地增强了CmDFR的表达，提高花青素的含量。当然植物MYB转录因子调控是一个复杂的过程，关于红花CtMYB-TF1转录因子在红花内的功能及调控机制还需要进一步试验证明，分析红花CtMYB-TF1转录因子的不同表达模式下花青素等代谢产物含量之间的关系，如此才能进一步对红花CtMYB-TF1转录因子进行更准确的定义。