右美托咪啶在南海近滩海水条件下对开放性颅脑损伤的抗炎和脑保护作用

冯龙 尹一恒 郑杨睿 汤浩 段明达 曹江北 袁维秀 张宏 余新光

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是全球范围内严重威胁人民健康的问题之一，是导致青壮年死亡或永久性残疾的重要因素，且具有很高的致死率和致残率，同是TBI 也是海军战争死亡和致残的主要原因[1-3]。由于海水低温、高渗、偏碱性及含有大量细菌等原因，导致开放性TBI 后继发性损伤程度均强于陆战伤，故海战伤的伤情和救治模式有很大不同。而南海海域的水温较高，海水理化性质及微生物分布与其他海域也有所不同，且针对南海海战颅脑损伤研究相对较少。目前研究发现新型镇静药右美托咪啶可通过降低蓝斑中去甲肾上腺素能神经元的活性来诱导镇静作用，从而增加腹侧前视神经核中抑制性γ-氨基丁酸神经元的活性[4]。同时该药对心律、血压和躁动有良好的作用，因此对于TBI患者的镇静是一种非常有用的镇静剂[5]。本研究主要通过建立开放性TBI 实验兔模型后经南海近滩海水浸泡后研究右美托咪啶是否具有抗炎症及脑保护作用。现报道如下。

材料与方法

一、实验动物

挑选3 月龄清洁健康雄性新西兰兔12 只，体质量2.5～3.0 kg，平均（2.7±0.3）kg，购自湖南长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：scxk (湘)2014-0010。本研究所有涉及动物的程序均已获得中国人民解放军医学院伦理委员会批准，并按照《实验动物的护理和使用指南》进行。

二、动物分组及模型制作

将12 只新西兰兔随机分为右美托咪啶组（Dex组，6 只）和对照组（Con 组，6 只）；其中Dex 组选择使用右美托咪啶注射液50 μg/kg （江苏恒瑞医药股份有限公司），Con 组给予相同剂量生理盐水。

根据Feeney 等[6]的实验模型进行改良制作开放性TBI。实验开始前2 d 所有实验兔进行单笼喂养，自由饮水及进食，且在实验前12 h 开始禁食。使用地西泮（3～5 mg/kg）进行静脉麻醉，观察5 min 后确认实验兔意识完全丧失后制作开放TBI 模型。兔头备皮后用碘伏消毒，全层切开头皮并于右侧顶部开颅，磨钻形成大小约2.0 cm×1.5 cm 骨窗，十字切开硬膜后翻转硬膜，显露右侧大脑半球皮质并用尖刀切开皮层约1 cm，由同一个操作者在颅脑开窗处挫裂损伤脑组织。全部实验兔建立模型后用南海近滩海水（海水取自海南省三亚市三亚湾）冲洗伤口60 min，随后Dex 组实验兔经腹腔注射给予50 mg/kg 盐酸右美托咪啶，Con 组给予相应剂量的生理盐水。冲洗伤口结束后，无菌操作全层缝合头皮，骨瓣未回纳。实验兔单独回笼继续观察48 h。

三、标本制备

建立模型48 h 后使用地西泮（3～5 mg/kg）麻醉，先抽取实验兔耳缘静脉血并使用临床可凝结生化管收集，随后在3000 r/min 离心3 min（离心半径13 cm）后收集血清，-80℃冻存以备后续使用。安乐处死实验兔完整取出伤侧大脑半球，观察伤侧大脑半球大体形态变化，从脑创伤区域部分取材，标本置于10%的福尔马林液中固定，石蜡包埋后行HE 染色。HE 染色具体步骤：首先将脑组织样本固定与切片，进行常规的石蜡包埋；然后把脑组织样本脱蜡处理，把脑组织样本依次置于95%、85%、70%乙醇中各浸泡5 min 进行水化；随后把脑组织切片分别行苏木素染色、分化与反蓝处理以及伊红染色和脱水处理；最后把脑组织切片风干封片在显微镜下1∶200倍数下拍照。

四、ELISA 法检测血清中炎性介质的表达

实验兔脑损伤48 h 后，取外周血离心后通过ELISA 法检测血清中各组炎性介质的表达变化。采用流式高通量多因子检测技术试剂盒（北京旷博生物技术有限公司） 测定血清细胞因子：白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）及中枢神经特异性蛋白（S100-β），经流细胞检测仪分析。实验步骤主要按照说明书进行，简要过程如下：把样品从-80℃冰箱取出，化融离心后加样，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；弃去液体，甩干，每个孔中加入工作液，酶标板加上覆膜，37℃温育1 h；再次弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1～2 min，大约350 μL/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；每孔加工作液，加上覆膜，37℃温育30 min；重复上述操作3 次，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次；每孔加底物溶液，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 min；最后每孔加终止液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色，即刻采用450 nm 波长的酶标仪测量各孔的光密度值。

五、统计学分析

采用SPSS17.0 软件进行统计学分析，所有数据均行正态分布和方差齐性检验，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，采用Student’s t检验。实验用图使用GraphPad Prism6 制作。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、实验兔脑组织HE 染色结果

Con 组脑细胞水肿主要表现为神经元和神经胶质细胞胞体明显肿胀，原有的椎体形状无法清晰辨认，细胞核浓染色，并且出现细胞核周围环形低染甚至是空白染色区（图1A）；而Dex 组经右美托处理后可明显改善以上组织细胞损伤和水肿的变化（图1B）。

图1 创伤性脑损伤后实验兔脑组织HE 染色结果

二、ELISA 法检测结果

与Con 组相比，Dex 组的炎症因子IL-1β、TNF-α、S100-β 水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而IL-6 水平变化差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 2 组实验兔脑创伤后48 h 后炎症因子水平的比较

讨论

TBI 是海军战争死亡和致残的主要原因，海战伤后继发性损伤程度均强于陆战伤。夏照帆和马兵[7]在现代战争条件下海战创伤救治中指出，海战伤伤情复杂、重伤多，同时爆炸伤（冲击伤）的发生明显高于其他环境条件下的作战，同时落水伤员救治难，受气候、海况等因素影响明显。海战伤患者经海水浸泡后，机体主要的抗氧化酶-超氧化物歧化物含量会降低，加重机体的二次损伤[8,9]。我国南海海域的水温较高，海水理化性质及微生物分布有所不同，Du 等[10]研究发现TBI 患者被南海高温海水浸泡后有助于细菌滋生加重感染，同时高盐度也可加重脑组织脱水性损伤。有研究发现，严重脑创伤患者中有7.7%～33%易并发阵发性交感神经过度兴奋（paroxysmal sympathetic hyperactivity，PSH）综合征，可引起严重的高体温、心动过速、高血压、呼吸急促、肌张力异常、高代谢状态以及难以控制的炎症反应等，严重影响患者预后[9,11]。正常应激反应时的交感神经兴奋对机体具有保护作用，而TBI 患者持续过度的交感神经兴奋可导致血流动力学不稳定或增加二次脑损伤等风险[11]。目前在TBI 患者中常用的镇静药中，丙泊酚具有降低脑灌注压的优点，但长期输注可导致乳酸中毒、心功能不全和胰腺炎等；咪唑安定也可引起该类患者发生谵妄，长期输注会出现易耐受和增加代谢产物等，因此常用的镇静药在TBI患者中的使用明显受限[12]。Lump 和Moyer[13]发现右美托咪啶可有效地抑制TBI 患者PSH 综合征导致的自主神经不稳定，同时也可减少麻醉药和镇静药的使用。本研究通过建立开放性TBI 实验兔模型，探讨经南海近滩海水浸泡后，使用右美托咪啶是否具有抗炎症及脑保护作用。

从TBI 初期脑组织的直接震荡损伤，到继发脑疝和后期脑血管损伤引起缺血损伤过程中，生物化学的变化对病变早期的病理改变起重要调控作用，而后期的病理生理改变是以炎症介质（包括IL-1β、TNF-α、IL-6）持续释放为主[14]。本研究结果显示，在TBI 兔模型的创伤初期，给予右美托咪啶可明显降低脑组织水肿和损伤，TBI 后48 h，给予右美托咪啶可显著降低血液中IL-1β、TNF-α 的水平，而起到抗炎脑保护作用。2 组的IL-6 水平无明显变化，其原因可能与观察时间相关。Taupin 等[15]研究发现IL-6 水平在TBI 后8 h 达高峰，18 h 候开始下降，而本研究观察时间为TBI 后48 h，可能该介质在48 h 后已恢复到创伤前水平。此外，Ding 等[16]和Singhal 等[17]也发现右美托咪啶在TBI 后使用可明显降低损伤后24 h 后和48 h 后的炎症因子水平，具有明显的抗炎作用。

众所周知，血浆中S-100β 可早期预估创伤程度、继发脑损伤以及预后的指标[18]。本研究也发现右美托咪啶可明显降低TBI 模型实验兔48 h 后的S100-β水平，说明该药具有很好的脑保护作用，与Li 等[19]、Shen 等[20]、Schoeler 等[21]的结果一致。该药的神经保护作用机制可能与激动α2受体和咪唑啉Ⅰ1 受体相关[19-21]。Dahmani 等[22]也发现右美托咪啶具有神经保护作用，其作用机制主要是通过α2 肾上腺素受体-FAK-PI3K-AKt 和咪唑啉Ⅰ1 受体-ERK1&2-MitoKATP 信号通路调控。其中细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信号通路与ERK 受体有关，该蛋白激酶是细胞存活的重要调控者和各种药物起神经保护作用的重要中介物[23]。

综上所述，南海近滩海水海战开放性TBI 后给予右美托咪啶可显著降低炎症因子水平，且可明显降低脑损伤指标S100-β 的水平。因此，在海战开放性TBI 后使用右美托咪啶具有一定的抗炎和脑保护作用，但其具体作用机制还有待进一步研究明确。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突