精子DFI与精液常规、精子形态学的相关性及其对IVF-ET/ICSI结局的影响

查晓敏，朱复希，张静静，徐元宏

据世界卫生组织（WHO）调查报告显示，不孕不育患者在育龄夫妇中占比约15%，其中男性因素占50%［1］。男性不育主要通过检测精子浓度、活动力等参数判断精液质量高低。由于精子的浓度和活动力容易受各种因素影响，同时临床中发现精液常规检查结果相仿的患者也存在明显不同的受精率和妊娠结局，说明精液常规检查结果用于男性不育及生育结局评估还不够全面。此外，有研究指出无论男性不育症患者精液常规检查结果是否正常，都可能存在精子DNA异常［2］，因此急需寻找一种新的预测指标。精子DNA碎片指数（DFI）是一项独立于精液常规检查之外，从分子水平反映精子DNA损伤，评估男性生育力，并在一定程度上可预测辅助生殖技术（ART）临床结局的参数，近年来受到广泛关注［3］。与精液常规相比，精子DFI变异小、检查快速、结果稳定，被认为是评价男性精液质量和预测男性生育力更有潜力、更加准确的指标。本研究在严格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影响后用精子染色质结构分析（SCSA）法检测精子DFI，研究其评估男性生育力及预测体外受精-胚胎移植（IVFET）/卵胞浆内单精子注射（ICSI）结局的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2017年9月—2019年4月安徽医科大学第一附属医院生殖中心2 420例男性不育患者，年龄19～66岁，平均（32.29±5.94）岁。纳入标准：（1）夫妻双方第1次接受IVF-ET或ICSI治疗。（2）精子畸形率≤96%。（3）女方年龄≤40岁，体质量指数（BMI）≤30 kg/m2，我院门诊就诊首次检测卵泡刺激素（FSH）＜10.00 IU/L，不孕病因仅为输卵管或卵巢因素且获卵数≥5个。排除标准：（1）男方存在严重少精子症（男方精子浓度＜5.00×106/mL）。（2）女方存在双子宫、单角子宫、纵隔子宫等生殖器畸形，以及存在重度子宫腔粘连、内膜过薄等影响胚胎着床的情况。（3）女方合并有甲状腺疾病、糖尿病等内分泌疾病。在2 420例患者中选择117对不孕夫妇，根据患者情况选择不同体外受精方式，根据体外受精方式分组。其中IVF组71对，男方年龄23～49岁，平均（33.51±6.32）岁，女方年龄23～40岁，平均（30.93±4.38）岁；ICSI组46对，男方年龄25～50岁，平均（33.50±5.80）岁，女方年龄23～39岁，平均（30.50±3.76）岁。

1.2 研究方法

1.2.1 精液标本采集患者禁欲3～7 d后，用无毒、无菌容器采集全部精液，并立即置于37℃孵箱内，30 min内观察精液是否液化，液化后取出标本，用吸管吸取足够样本进行检测。

1.2.2 精子DFI检测采用美国BD（Becton，Dickinson and Company）公司流式细胞仪（accuri C6）精子染色质结构分析（SCSA）法配合流式细胞术，检测试剂盒为精子核完整性染色试剂盒［浙江星博生物科技有限公司，YZB/浙（甬）0159-2-12］。调整精子浓度为1×106～2×106个/mL，取100μL用流式细胞术检测精子DNA完整性，分析5 000条以上为有效数据，利用吖啶橙染料的异染性质，使完整的双链DNA精子核显示绿色荧光，受损的单链DNA精子核显示红色荧光。根据DFI值分为A组（DFI≤15%，精子DNA完整性好）、B组（15%＜DFI＜30%，精子DNA完整性一般）、C组（DFI≥30%，精子DNA完整性差）。IVF组与ICSI组分别根据精子DFI水平进一步各分为3个亚组，即IVF-1组（DFI≤15%）、IVF-2组（15%＜DFI＜30%）、IVF-3组（DFI≥30%）；ICSI-1组（DFI≤15%）、ICSI-2组（15%＜DFI＜30%）、ICSI-3组（DFI≥30%）。

1.2.3 精液质量分析参照第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》采用计算机辅助精子分析系统（computer assisted sperm analysis，CASA）分析精液，应用西班牙SCA全自动精子质量分析仪。精液参数正常范围：精液量≥1.5 mL，精子浓度≥15×106/mL，前向运动精子（PR）≥32%，精子活动率≥40%。

1.2.4 精子形态分析精子形态学按照第5版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》推荐方法，采用巴氏染色法，苏木素-EA50染液染色进行精子形态学分析，观察精子畸形率。

1.2.5 IVF-ET和ICSI治疗女方按常规促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-α）长方案进行，通过阴道B超及血清雌二醇（E2）水平监测卵泡发育，卵泡发育成熟后肌内注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），36 h后在B超引导下取卵，采用上游法或密度梯度离心法优化处理精液，取卵4～6 h后行IVF或ICSI，授精后16～18 h观察受精情况。根据Gardner法对囊胚进行评级，将D5评分≥3BB或D6评分≥4BB定义为优质胚胎；选择1～2个优质胚胎冷冻后解冻移植，移植后行黄体支持。移植35 d后B超下见孕囊原始心管搏动为临床妊娠。

1.2.6 IVF/ICSI临床结局计算方法IVF受精率=（受精卵数/获卵总数）×100%；ICSI受精率=（受精卵数/MⅡ卵数）×100%；卵裂率=（受精卵裂胚胎数/受精卵数）×100%；优质胚胎率=（优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数）×100%；临床妊娠率=（临床妊娠周期数/所有移植周期数）×100%

1.3 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料进行正态性和方差齐性检验，不符合正态分布和方差齐性的数据采用M（P25，P75）表示，组间比较Kruskal-WallisH检验，两两比较用Nemenyi检验，相关性分析用Spearman法，符合正态分布和方差齐性的数据采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验；计数资料以例或例（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组患者临床资料比较A、B、C组患者年龄、精子DFI、精子畸形率逐次升高，精子浓度、PR、精子活动率逐次降低（P＜0.01），3组患者精液量差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of conventional parameters and deformity rate of sperm between different DFI groups表1 不同精子DFI组精液常规参数、畸形率比较

2.2 精子DFI与精液常规参数、精子畸形率相关性分析精子DFI与年龄、精子畸形率呈正相关（rs分别为0.186、0.302，均P＜0.01），与精子浓度、PR、精子活动率呈负相关（rs分别为-0.289、-0.618、-0.620，均P＜0.01）。

2.3 各亚组间临床资料比较见表2。与IVF-1组比较，IVF-3组精子浓度、PR降低；IVF-3组精子畸形率较IVF-2组升高；与ICSI-1组和ICSI-2组比较，ICSI-3组PR降低；ICSI-3组精子畸形率较ICSI-1组升高（P＜0.05）。IVF及ICSI组中各亚组间女方年龄、BMI、FSH、获卵数及男方年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

Tab.2 Comparison of basic characteristics,semen parameters and malformation rate between three subgroups表2 各亚组间基本特征、精液参数、畸形率比较

2.4 各亚组临床结局比较在IVF组和ICSI组中，各亚组受精率、优胚率、临床妊娠率及卵裂率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of clinical outcomes between different subgroups表3 各亚组间临床结局比较

3 讨论

精子DFI是反映精子染色质结构，评估男性生育力，并在一定程度上可预测ART临床结局的参数。有报道指出高DFI可对精液质量和ART结局产生不良影响［4］，但关于精子DFI与年龄、精液常规参数、畸形率的相关性及对ART结局的影响一直有争议。本研究在严格控制女方因素和男性患者精子高畸形率的影响后用SCSA法检测精子DFI，研究精子DFI评估男性生育力及预测IVF-ET/ICSI结局的价值。

3.1 精子DFI与年龄、精液常规、畸形率之间的关系本研究对2 420名男性患者精子DFI、年龄、精液常规、精子形态学进行分析，结果显示精子DFI与年龄、精子畸形率呈正相关，与精子浓度、PR、活动率呈负相关；与A组和B组比较，C组年龄、精子畸形率升高，精子浓度、PR、精子活动率降低，与既往研究［5-6］一致。人类成熟精子核由组蛋白（15%）和鱼精蛋白（85%）结合形成复合体。鱼精蛋白是一种小分子碱性蛋白质，通过中和DNA的负电荷并与二硫键交联使细胞核更为致密。在精子核成熟过程中，精子染色质内的组蛋白被只有其一半体积的鱼精蛋白通过中间过渡蛋白形成鱼精蛋白-DNA复合体。鱼精蛋白-DNA复合体形成高度浓缩的染色质结构，使精子核极度压缩，保护精子抵抗外界氧化或高温等，有利于精子在生殖道内的运动和受精，使遗传物质准确进入胚胎。畸形精子由于细胞核内鱼精蛋白-DNA复合体减少，不能压缩精子核，导致精子核内存在大量体积较大的组蛋白，精子染色质结构疏松，精子DNA易发生损伤，且畸形精子产生的氧自由基（ROS）也可导致精子DNA损伤，最终使精子DNA碎片增多，精子DFI升高，表明精子DFI与精子畸形率相关，Yang等［7］研究也证实了这一点。而Le等［8］研究结果显示精子DFI与精液常规各参数、畸形率相关性较弱，李红芳等［9］研究亦指出精子DNA碎片率与精液常规各参数无相关性。对比分析原因可能与以下因素有关：（1）精子DFI检测方法不同。（2）样本量、研究方法和男性患者纳入标准不同。Le等［8-9］采用染色质分散试验（SCD）法，样本量小（318例和112例），而本研究采用检测精子DNA损伤金标准的SCSA法配合流式细胞术，且样本量较大，更具有代表性。

3.2 精子DFI与IVF/ICSI临床结局的关系本研究结果显示IVF组和ICSI组受精率、卵裂率、优胚率、临床妊娠率差异均无统计学意义，与既往研究［10-11］结果一致。但Simon等［12］通过Meta分析表明精子DFI较高会降低IVF/ICSI临床妊娠率，原因可能为：（1）精液经过上游法和密度梯度离心优化精子处理后精子DFI、畸形率降低，使得高精子DFI对临床妊娠结局的影响减弱。（2）胚胎移植时优先选择优质胚胎，这可能也是造成精子DFI与临床妊娠结局无关的原因。（3）胚胎早期发育受母源性基因控制，精子DNA损伤被部分修复后成功妊娠，后期父源性基因激活发挥作用，精子DFI高患者胚胎可能最终无法持续妊娠至3个月后或者最终生产。Cissen等［13］也认为没有足够的证据推荐在进行ART夫妇中常规使用精子DNA碎片测试来预测妊娠和选择治疗方案，需要进一步研究精子DFI对3个月后妊娠率的预测价值，同时与3个月后妊娠的其他预测因子如女性年龄、男性年龄、精液参数和卵母细胞数量等进行比较。Esteves等［14］也提出出生率是评估精子DNA碎片化试验的终点，并提出在IVF和ICSI组高精子DFI导致低出生率。

综上所述，精子DFI与年龄、精子浓度、PR、精子活动率、畸形率相关，建议将精子DFI检测作为精液分析的常用项目，以完善对男性生育能力的评价，并指导治疗。精子DFI对IVF/ICSI临床结局无预测价值，不建议将精子DFI检测作为选择ART方案时的检查项目。