桂枝茯苓丸联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖与凋亡的影响

周丽萍，雷 蕾，楚国庆，杨锦亮，李建红，金建宁

卵巢癌是当今社会最常见的病死率很高的恶性肿瘤[1]，因卵巢解剖位置深，故初期起病较隐匿，早期症状不明显，大多数患者就诊时已到晚期，临床治疗效果及预后都不甚理想[2-3]。目前，卵巢癌治疗方面以手术及术后给予顺铂、紫杉醇为基础的联合化疗为主，但患者的5年生存率仍较低[4]，然而紫杉醇联合铂类药物作为治疗卵巢癌的一线化疗药物，极易产生耐药性，最终导致复发率大于50%[5]，且患者生存质量差。基于此，找到有效的抑制卵巢癌耐药、提高患者生存质量的方法具有重要意义。临床观察发现，桂枝茯苓丸联合化疗药物比单一运用化疗药物更能提高临床疗效以及患者生活质量，但其机制目前尚不明确，故本实验研究目的旨在为桂枝茯苓丸的临床运用提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料：实验室所用细胞为人卵巢癌SKOV-3细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：C-0215；桂枝茯苓丸主要组成有桂枝、茯苓、丹皮、芍药、桃仁，所有生药购自宁夏明德医药有限公司，采用常规醇提法煎煮，制备成质量浓度9 g/mL,冷却后储存至4 ℃冰箱备用。注射用顺铂(冻干型)购自江苏豪森药业集团有限公司(批号：601191201)，规格30 mg，生理盐水配置成1 mg/ml冷藏备用。

1.1.1 试剂:McCoy,s 5A培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司，批号：WHO1111806XP)；CLARK胎牛血清(上海慧颖生物科技有限公司，批号：FB25015)；0.25%胰蛋白酶溶解液(北京索莱宝科技有限公司，批号：T1320)；Cleaved-Caspase 3Antibody(Affinity，批号：AF7022)；Cytochrome c Antibody(Affinity，批号：AF0146)；BCL-2 Antibody，(Affinity，批号：AF6139)；β-actin抗体(北京中杉，TA-09)。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、细胞周期检测试剂(上海凯基生物技术股份有限公司)。

1.1.2 动物：SPF级雌性SD大鼠，体质量220～300 g，购自宁夏医科大学动物实验中心。动物许可证号:SCXK(宁)2015-0001，饲养于恒湿、恒温的笼具中，自由摄入标准大鼠饲料和无菌水。适应1周后进行试验。

1.1.3 仪器:CO2培养箱(德国nuaire公司)；蛋白浓度定量仪(Eppendorf公司)；电泳仪(北京六一公司)；半干转膜仪系统(ATTO公司)；CKX31倒置显微镜(日本olympus公司)；TDZ5-WS台式低速离心机(长沙湘仪仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备：SD大鼠48只，按体重随机分为4组:生理盐水组(N组)、桂枝茯苓丸组(中药组，G组)、顺铂组(DDP组)、桂枝茯苓丸+DDP组(联合组，GD组)，每组12只。给药方式：生理盐水组给予生理盐水；桂枝茯苓丸组给予水煎剂，每次2 mL，连续给药5 d；DDP组在实验的第1、3、5 d按所需剂量腹腔注射各1次；联合组同时给予桂枝茯苓丸和DDP组的相应剂量。各实验组大鼠在末次给药2 h 后，心脏取血，静置1 h，分离血清，同组大鼠所得血清混合以消除个体差异，56 ℃、30 min灭活处理，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后分装，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 细胞培养：配置含10%的胎牛血清的完全培养基(含1%青霉素、链霉素)培养SKOV-3细胞，孵育于37 ℃、5% CO2和90%湿度的培养箱中，隔日更换新的培养液，继续培养。待细胞长满瓶底70%～80% 时进行传代，取对数生长期细胞用于实验。将细胞分为对照组、生理盐水组、DDP组、桂枝茯苓丸组、桂枝茯苓丸+DDP组。

1.2.3 MTT法检测细胞活性：取对数生长期的细胞，以5×103个/mL接种于96孔板培养，待细胞贴壁后吸弃原培养液，各实验组分别加入相应5%、10%、20%浓度的含药血清培养液100 μL，对照组为正常培养细胞，每组设 3 个复孔，继续培养24、48 h。之后每孔加入20 μL MTT，37 ℃ 继续培养4 h 后终止培养，小心吸弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡器低速振荡10 min，在酶标仪490 nm波长处测定各孔光密度值(OD值)，并计算生长抑制率：生长抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期：取处于对数生长期的细胞，计数后以5×105个/mL接种于6孔板中，培养24 h 后给药，各组分别加入相应20%浓度的含药血清继续培养48 h，之后用0.25%的不含EDTA胰酶消化，收集细胞。离心后用冷PBS液洗涤2次，将细胞充分混匀，用70%冷乙醇-20 ℃固定24 h。检测前离心去除乙醇固定液，PBS清洗1次，加入20 μl的RNase酶，37 ℃水浴30 min，再加入500 μl的碘化丙锭(PI)溶液，避光染色30～60 min，400目网过滤后于流式细胞仪检测。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase 3蛋白水平：将各组刺激细胞24h后，PBS洗1次，加入细胞裂解液100 μl，加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解1 h，12 000 r/min离心10 min，取上清液，蛋白定量后，加入2*上样缓冲液，煮沸5 min，12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳转印到硝酸纤维素膜上，利用Bcl-2、Cyt C、Cleaved Caspase 3特异性抗体和辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗检测，加底物发光显影。将胶片扫描后，用TanonGis软件测定条带灰度值。

2 结果

2.1 各组含药血清对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响：见表1。与生理盐水组相比，DDP组、桂枝茯苓丸组、联合组细胞抑制率均增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；桂枝茯苓丸组、DDP组都可抑制细胞增殖，但差异无统计学意义(P>0.05)；与DDP组、桂枝茯苓丸组相比，联合组细胞抑制率增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；同一加药处理组在相同处理时间的条件下，随着含药血清浓度的增加，细胞抑制率逐渐增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；相同浓度含药血清干预的条件下，同处理组48 h较24 h细胞抑制率增高；20%浓度的含药血清处理48h时，对细胞增殖的抑制率最高。桂枝茯苓丸可抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖活性。

表1 各浓度含药血清对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖活性的影响

2.2 各组含药血清对人卵巢癌SKOV-3细胞周期的影响：SKOV-3细胞处理48h后，与生理盐水组相比，DDP组、桂枝茯苓丸组、联合组G0/G1期比例上升，而S期比例下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。桂枝茯苓丸可能将人卵巢癌SKOV-3细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞增殖，见表2。

表2 各组含药血清对SKOV-3细胞周期的影响

2.3 各组含药血清对人卵巢癌SKOV-3细胞Bcl-2、Cyt C、Caspase-3蛋白表达的影响：见表3，DDP组、桂枝茯苓丸组含药血清可上调人卵巢癌SKOV-3细胞中Cyt C、Caspase-3蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达。与生理盐水组相比，DDP组、桂枝茯苓丸组、联合组SKOV-3细胞内Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与DDP组、桂枝茯苓丸组相比，联合组SKOV-3细胞内Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05),见图1(封三)。

表3 各组SKOV-3细胞内Bcl-2、Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达情况

3 讨论

卵巢癌是女性癌症死亡的第四大原因[6]。目前，治疗卵巢癌常用的方法是手术及放化疗，而对于卵巢癌化疗的一线治疗方案紫杉醇联合卡铂给患者带来的毒副作用及耐药性也成为现在治疗卵巢癌需要攻克的一大难题。近年来，许多研究发现，中医药在治疗肿瘤方面作用凸显，为治疗肿瘤提供了新思路。

细胞凋亡是由基因控制的程序性的细胞死亡，而肿瘤发生的基础是细胞凋亡异常。细胞凋亡有多个信号途径调控，线粒体途径在细胞凋亡中起着重要的作用，Bcl-2家族蛋白可调控线粒体凋亡途径，Bcl-2属于抑制细胞凋亡的抗凋亡蛋白，可调节线粒体膜的通透性，诱导促凋亡因子Cyt C的释放，从而促进细胞凋亡[7]。正常情况下，Cyt C存在于线粒体膜间隙中，当细胞接收到凋亡信号之后，释放Cyt C至细胞浆中，在三磷酸脱氧腺苷的参与下与凋亡蛋白酶活化因子结合，激活Caspase-9及Caspase-3[8]，从而诱导细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡最终的执行者，其活性对细胞凋亡有重要意义，且Caspase-3活化过程中可产生活性片段Cleaved-Caspase-3，Cleaved-Caspase-3的表达水平可反应Caspase-3的活性程度和凋亡水平[9-10]。

卵巢癌在中医中可归属为“积聚”“癥瘕”的范畴。《医学正传》说明:“积者迹然，挟痰血浓而成形迹，遂郁积久之谓至。”妇女素体虚弱、经期受风等都可使寒邪积聚，导致气血运行不畅，最终导致瘀阻胞宫，形成癥瘕[11-12]。总的来说，古代一些医家对卵巢癌病因的认识主要是血瘀气滞。桂枝茯苓丸出自张仲景《金匮要略》，方中以桃仁、牡丹皮活血化瘀；配五等量白芍，以养血和血，其次可去瘀养血，使瘀血去而新血生；加入桂枝，既可温通血脉以助桃仁活血化瘀之力，又可得白芍以调和气血；以茯苓之淡渗利湿，寓有湿祛血止之用。综合全方，主活血散瘀、消癥止血之功。现代研究证实[13]，桃仁可抑制肿瘤细胞增殖、浸润、转移，诱导肿瘤细胞凋亡进而发挥抗肿瘤作用；牡丹皮中有效成分丹皮酚可逆转肿瘤多药耐药性[14]；白芍有效成分白芍总苷能在不同环节对细胞免疫和体液免疫进行调节[15]；桂枝中挥发油主要成分桂皮醛有抗肿瘤作用[16]；茯苓中主要化学成分茯苓多糖具有明显抗肿瘤作用[17]。徐晓焱[18]通过流式细胞仪检测到桂枝茯苓丸可使荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡数目增加，延长其生命周期。杨运高[19]等发现，桂枝茯苓丸对肿瘤转移有抑制作用。

本实验用MTT法观察了不同浓度桂枝茯苓丸联合DDP含药血清对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖活性的抑制作用，流式细胞仪检测20%浓度桂枝茯苓丸联合DDP含药血清对SKOV-3细胞周期的影响及Western blot检测Bcl-2、Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达的情况。实验结果表明，桂枝茯苓丸联合DDP可显著抑制人卵巢癌SKOV-3细胞的增殖活性，将SKOV-3细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖；还可上调Cyt C、Cleaved-Caspase-3蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达。表明桂枝茯苓丸联合DDP可通过线粒体途径诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡。