百花花楸果中β-谷甾醇及其衍生物的制备及抗抑郁活性研究

刘晓峰 曹馨元 尹永霞 王波 黄文华

摘 要 目的：制備百花花楸果中β-谷甾醇（简称为“Sit”）及其衍生物，并考察其抗抑郁活性。方法：以百花花楸果实为原料，经过75%乙醇和20%KOH溶液提取，并经萃取结晶后得到Sit。以Sit的C3位羟基作为结构修饰位点，以二氯甲烷为反应溶剂、4-二甲氨基吡啶为催化剂、1-（3-二甲胺基丙基）-3-乙基碳二亚胺为脱水剂，分别加入4种有机酸（水杨酸、2-四氢糠酸、苯丙氨酸、山梨酸），通过羧合反应生成相应的酯类衍生物Sit-S、Sit-T、Sit-P、Sit-Sr，并采用红外和核磁共振等波谱技术鉴定其化学结构。根据悬尾实验和强迫游泳实验初步探讨Sit及其4种衍生物的抗抑郁活性，然后再根据悬尾实验和自发运动能力实验筛选抗抑郁活性较好的化合物的有效剂量。将筛选出的该化合物单用以及分别与阿戈美拉汀[40 mg/kg，5-羟基色胺（5-HT）和5-HT 2C受体拮抗剂]、氟哌啶醇[0.2 mg/kg，非选择性D2受体拮抗剂]和荷包牡丹碱[4 mg/kg，竞争性γ-氨基丁酸（GABA）拮抗剂]联用，腹腔注射给药60 min后，进行悬尾实验，然后通过酶联免疫吸附法检测小鼠脑组织中5-HT、多巴胺（DA）、GABA水平，初步探索该化合物的抗抑郁作用机制。实验均设置空白对照组，腹腔注射等量10%丙二醇溶液。结果：经波谱技术鉴定，Sit与4种有机酸成功地反应生成了相应的酯类衍生物。在Sit及其4种衍生物中，Sit-S组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间均最短，且显著短于空白对照组（P<0.05）。Sit-S的筛选结果显示，其抗抑郁的有效剂量为4 mg/kg，且与空白对照组比较不影响小鼠的自发活动（P>0.05）。该剂量作用下，Sit-S可显著缩短小鼠在悬尾实验中的不动时间（P<0.01），显著提高小鼠脑组织中5-HT、DA和GABA水平（P<0.05或P<0.01），但该作用效果可被阿戈美拉汀、氟哌啶醇和荷包牡丹碱不同程度地逆转。结论：Sit的水杨酸酯衍生物Sit-S具有良好的抗抑郁活性，其作用机制可能是通过提高脑组织中5-HT、DA和GABA水平所介导的。

关键词 百花花楸果;β-谷甾醇;衍生物;抗抑郁活性

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare β-sitosterol （shorted for “Sit”） and its derivatives from the fruit of Sorbus pohuashanensis， and to investigte their antidepressant activities. METHODS： Using the fruit of S. pohuashanensis as raw material， extracted with 75% ethanol and 20%KOH solution， Sit was obtained after extraction and crystallization. C3 hydroxyl group of Sit was used as the structural modification site， CH2Cl2 was used as the reaction solvent， DMAP was used as catalyst， EDCI was used as dehydrating agent， 4 kinds of organic acids （salicylic acid， 2-tetrahydrofuranic acid， phenylalanine， sorbic acid） were added to make the carboxylation reaction to produce ester derivatives Sit-S， Sit-T， Sit-P and Sit-Sr. The chemical structure of its derivatives were elucidated by IR and NMR. The tail suspension test and the forced swimming model were used to preliminarily explore the antidepressant active components of Sit and 4 kinds of derivatives; tail suspension test and the spontaneous exercise capacity test were used to screen effective dose of the compounds with antidepressant active. The compound was used alone or in combination with agomelatin [40 mg/kg， 5-hydroxytryptamine （5-HT） and 5-HT 2C receptor antagonist]， haloperidol [0.2 mg/kg， non-selective D2 receptor antagonist] and bicuculline [4 mg/kg， competitive γ-aminobutyric acid （GABA） antagonist]， respectively. Sixty minutes after intraperitoneal injection， tail suspension test was performed. The levels of 5-HT， dopamine （DA） and GABA in brain tissues of mice were detected by ELISA. The blank control group was given intraperitoneal injection of 10% propylene glycol solution. RESULTS： By spectrum technology， the corresponding ester compounds were synthesized by the reaction of Sit with four kinds of organic acids. Among Sit and its four derivatives， the immobility time of Sit-S group was the shortest in tail suspension test and forced swimming test， which was significantly shorter than that of blank control group （P<0.05）. Screening results of Sit-S showed that the effective antidepressant dose was 4 mg/kg， and it did not affect the spontaneous activity of mice compared with the blank control group （P>0.05）. With this dose， Sit-S could significantly shorten the immobility time of mice in tail suspension test （P<0.01）， and can significantly increase the levels of 5-HT， DA and GABA in the brain tissue of mice （P<0.05 or P<0.01）， but its effect can be reversed by agomelatine， haloperidol and bicuculline to different extent. CONCLUSIONS： Sit salicylate derivatives Sit-S exhibits good antidepressant activity， and its mechanism of action may be mediated by increasing the levels of 5-HT， DA and GABA.

2.3 Sit衍生物的合成

按照文献报道的方法[15]，本研究选用二氯甲烷为反应溶剂、DMAP为催化剂、EDCI为脱水剂，分别加入不同有机酸（水杨酸、2-四氢糠酸、苯丙氨酸、山梨酸），使之发生羧合反应生成酯类化合物。以水杨酸β-谷甾醇酯（Sit-S）为例的合成过程：将水杨酸41.4 mg和Sit 83.0 mg在5 mL二氯甲烷中混合后，加入脱水剂EDCI 76.8 mg脱水10 min后，加入催化剂DMAP 7.4 mg，将该溶液加热回流6 h;减压除去溶剂，将残余物先在常温下通过硅胶254色谱柱洗脱，然后再采用石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（7 ∶ 7 ∶ 1，V/V/V）洗脱，得到浅黄色油状胶体（95.8 mg），即为Sit-S。同法制备2-四氢糠酸、苯丙氨酸、山梨酸与Sit生成的酯类衍生物Sit-T、Sit-P、Sit-Sr。通过HPLC法确定4种衍生物的纯度均大于98%。Sit的母核及其衍生物的结构见图2。

2.4 Sit衍生物的结构确证

采用傅里叶变换红外光譜法（IR）和核磁共振氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）等技术对化合物进行结构确证。

2.4.1 Sit-T 分子式为C34H56O4，分子量为528。IR光谱：2 964～2 888 cm-1处有饱和烷烃的碳氢单键伸缩振动信号（υCH），提示存在饱和烷烃基团;1 738 cm-1处有羰基碳氧双键的伸缩振动信号（υC=O），提示存在羰基;   1 629 cm-1处有碳碳双键的伸缩振动信号，提示存在碳碳双键（υC=C）;1 384、1 372 cm-1处有甲基碳氢变形振动信号，提示有多个甲基存在。1H-NMR（300 MHz， CDCl3）δ：5.377（d，1H，J=4.8 Hz，6-H），4.681（m，1H，2″-H），4.433（m，1H，3-H），4.025（dd，1H，J=7.2、14.4 Hz，5″-Ha），3.940（m，1H，5″-Hb），1.010（s，3H，10-CH3），0.922（d，3H，2′-CH3），0.859（t，3H，5′-CH3），0.813（d，6′，6′-CH3），0.668（s，3H，13-CH3）;2.343～0.753处的信号为甾体母核、甾体17侧链和2-四氢糠酸中其他饱和碳上的氢信号。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：172.67（C1′），139.41（C5），122.68（C6），76.79（C2″），74.33（C3），69.17（C5″），56.63（C14），56.01（C17），49.99（C9），45.82（C24），42.25（C13），39.67（C12），37.95（C4），36.89（C1），36.51（C10），36.06（C20），33.91（C22），31.81（C3″），30.12（C7，8），29.16（C25），28.13（C2），27.63（C23），26.13（C15），25.09（C4″），24.20（C16），23.04（C28），20.96（C11），19.70（C26），19.20（C27），18.98（C21），18.70（C18），11.89（C29），11.76（C19）。

2.4.2 Sit-P 分子式为C37H59NO3，分子量为565。IR光谱：3 450 cm-1处有氨基氮氢单键的伸缩振动信号，提示有氨基存在;3 044 cm-1处有碳氢键伸缩振动信号，提示有碳氢键的存在;1 734、1 722 cm-1处有羰基碳氧双键伸缩振动信号，提示有羰基存在;1 670 cm-1处有双键碳碳骨架伸缩振动信号，提示甾体母核中有双键的存在;      1 384、1 370 cm-1处有甲基碳氢变形振动信号，提示有多个甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.311（m，2H，3′，5′-H），7.276（m，2H，2′，6′-H），7.140（m，1H，4′-H），5.371（d，1H，J=4.8 Hz，6-H），5.034（d，1H，J=8.1 Hz，2′-NH），4.642（m，1H，3-H），3.080（m，1H，2′-H），1.416[s，3H，1[″][″]-（CH3）3]，1.001（s，3H，18-H），0.936（d，3H，J=6.6 Hz，21-H），0.873（t，3H，J=7.2 Hz，29-H），0.828（d，6H，J=6.6 Hz，26，27-H），0.679（s，3H，19-H）;2.383～0.767 处的信号为甾体母核、甾体17侧链和2-丁基羰基氨基苯丙酸基团中其他饱和碳上的氢信号。13C- NMR（75 MHz，CDCl3）δ：171.14（C1′），154.98（C1[″][′]），139.30（C5），136.06（C1″），129.36（C3″，5″），128.34（C2″，6″），126.82（C4″），122.78（C6），79.62（C1[″][″]），73.52（C3），56.59（C14），55.95（C17），54.46（C2′），49.92（C9），45.74（C24），42.22（C13），39.63（C12），37.83（C4），36.91（C3′），36.82（C1），36.47（C10），36.07（C20），33.85（C22），31.81（C7），31.76（C8），29.07（C25），28.23[C1[″][″]-（CH3）3]，28.17（C2），27.59（C23），25.99（C15），24.21（C16），22.99（C28），20.94（C11），19.76（C26），19.20（C27），18.98（C21），18.71（C18），11.91（C29），11.78（C19）。

2.4.3 Sit-Sr 分子式为C35H56O3，分子量为524。IR光谱：3 075 cm-1处有碳氢伸缩振动信号，提示有碳氢键的存在;2 975～2 877 cm-1处有饱和烷烃的碳氢单键伸缩振动信号（υCH），提示有饱和烷烃基存在;1 733 cm-1处有羰基碳氧双键伸缩振动信号，提示有羰基的存在;1 644 cm-1处有碳碳双键骨架伸缩振动信号，提示甾体母核中有双键存在;1 383、1 369 cm-1处有甲基碳氢变形振动信号，提示有多个甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.259（dd，1H，J=9.9，15.3 Hz，3′-H），6.213（dd，1H，J=9.9，15.3 Hz，4′-H），5.759（d，1H，J=15.3 Hz，2′-H），5.367（m，1H，6-H），5.357（m，1H，5′-H），4.675（m，1H，3-H），1.839（d，3H，J=5.7 Hz，6′-H），1.011（s，3H，18-H），0.914（d，3H，J=6.3 Hz，21-H），0.851（t，3H，J=7.2 Hz，29-H），0.806（d，6H，J=6.6 Hz，26，27-H），0.661（s，3H，19-H）;2.347～0.745处的信号为甾体母核、甾体17侧链和（2E，4E）-己烷-2，4-二壬基中其他饱和碳上的氢信号。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：166.67（C=O），144.68（C3′），139.70（C5），139.00（C5′），129.77（C4′），122.54（C6），119.43（C2′），73.67（C3），56.64（C14），55.98（C17），49.98（C9），45.78（C24），42.26（C13），39.68（C12），38.17（C4），36.98（C1），36.57（C10），36.11（C20），33.88（C22），31.86（C7），31.82（C8），29.09（C25），28.21（C2），27.82（C23），26.01（C15），24.25（C16），23.01（C28），20.98（C11），19.78（C26），19.29（C27），18.99（C21），18.73（C18），18.60（C6′），11.94（C29），1.81（C19）。

2.4.4 Sit-S 分子式为C36H54O4，分子量为550。IR光谱：3 450 cm-1处有羟基氢氧伸缩振动信号，提示有羟基存在;3 080 cm-1处有碳氢化合物伸缩振动信号，提示有饱和烷烃基团的存在;2 964 ～2 876 cm-1处有饱和烷烃的碳氢单键伸缩振动信号（υCH），提示有饱和烷烃基团存在;1 724 cm-1处有羰基碳氧双键伸缩振动信号，提示有羰基存在;1 614 cm-1处有双键碳碳骨架伸缩振动信号，提示甾体母核中有双键的存在;1 604、1 582 cm-1处有碳碳双键伸缩振动信号（υArC=C），提示有苯环存在;1 384、1 372 cm-1处有甲基碳氢变形振动信号，提示有多个甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：10.836（s，1H，2″-H），7.781（dd，1H，J=1.5，7.8 Hz，6″-H），7.377（dt，1H，J=1.5，7.8 Hz，5″-H），6.896（dd，1H，J=0.9，8.4 Hz，3″-H），6.807（dt，1H，J=0.9，8.4 Hz，4″-H），5.356（d，1H，J=4.5 Hz，6-H），4.818（m，1H，3-H），0.988（s，3H，10-CH3），0.864（d，3H，2′-CH3），0.798（t，3H，5′-CH3），0.752（d，6′，6′-CH3），0.612（s，3H，13-CH3）;2.403～0.630 处的信号为甾体母核、甾体17侧链中其他饱和碳上的氢信号。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：168.60（1′），160.76（C2″），138.30（C5），134.39（C4″），128.86（C6″），122.08（C6），117.90（C5″），116.51（C3″），111.90（C1″），74.26（C3），55.70（C14），55.11（C17），49.09（C9），44.89（C24），421.34（C13），38.75（C12），37.11（C4），35.99（C1），35.64（C10），35.15（C20），32.99（C22），30.93（C7），30.89（C8），28.25（C25），27.23（C2），26.80（C23），25.22（C15），23.30（C16），22.12（C28），20.07（C11），18.80（C26），18.33（C27），18.08（C21），17.80（C18），10.99（C29），10.86（C19）。

2.5 Sit及其衍生物对抑郁模型小鼠的抗抑郁活性考察

本课题组前期预实验结果显示，Sit-T、Sit-P、Sit-Sr和Sit-S在1～20 mg/kg的剂量范围内均有一定的抗抑郁样活性，故本研究初步选取2.5、10 mg/kg作为给药剂量，考察Sit及其4种衍生物的抗抑郁活性。分别取2批小鼠（每批88只），均随机分为空白对照组（10%丙二醇溶液）和Sit及其4个衍生物（Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S）的低、高剂量组（剂量均为2.5、10 mg/kg，以10%丙二醇溶液为溶剂溶解），每组8只。各组小鼠均腹腔注射给药，给药体积均为1.0 mL。给药1 h后，各取1批小鼠分别进行悬尾实验和强迫游泳实验[16-17]。（1）悬尾实验：将小鼠的尾巴悬挂固定在一个距离地面约40 cm的水平杆上，小鼠头部朝下呈倒悬状。每只小鼠均用不透明的硬纸板隔开，小鼠距离其周围空间不少于15 cm。观察小鼠的扭攀挣扎情况，当其四肢静止不动时，记录其不动时间。（2）强迫游泳实验：将小鼠单独放置在一个水位高15 cm的开放型玻璃瓶（14 cm×30 cm×25 cm）内，水温为（24±2） ℃。从小鼠入水后开始计时，总实验时间为6 min，记录后4 min内小鼠的持续不动时间（即小鼠在水中停止挣扎或呈漂浮状态，仅使头部露出水面的不动时间）。上述不动时间越长，表明小鼠抑郁状况越严重。采用SPSS 19.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。各组小鼠悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间测定结果见表1。

结果显示，与空白对照组比较，Sit低剂量组，Sit-T低剂量组，Sit-P低、高剂量组，Sit-Sr低剂量组和Sit-S低、高剂量组小鼠在悬尾实验中的不动时间显著缩短（P<0.05或P<0.01），而Sit高剂量组小鼠在悬尾实验中的不动时间显著延长（P<0.05）;Sit-T低剂量组，Sit-Sr低剂量组和Sit-S低、高剂量组小鼠在强迫游泳实验中的不动时间显著缩短（P<0.05）。结果提示，衍生物Sit-S对小鼠不動时间影响最为显著，故后续研究中重点对Sit-S的抗抑郁作用进行考察。

2.6 Sit-S抗抑郁有效剂量的筛选

分别另取2批小鼠（每批48只），均随机分为空白对照组（10%丙二醇溶液）和Sit-S不同剂量组（0.5、1、2、4、6 mg/kg，以10%丙二醇溶液为溶剂制备），每组8只。各组小鼠均腹腔注射给药，给药体积均为1.0 mL。给药1 h后，各取1批小鼠分别进行悬尾实验和自发运动能力测试实验[18]。（1）悬尾实验：方法同“2.5”项下，测定各组小鼠的不动时间。（2）自发运动能力测试实验：将小鼠放置于小鼠自主活动测试仪器中，观察每只小鼠在黑暗、安静的环境中的自发运动活性。在小鼠适应3 min后，观察并记录其在后续4 min内的自主活动次数。按照“2.5”项下统计学方法进行数据分析。各组小鼠的不动时间和4 min内的自主活动次数测定结果见表2。

结果显示，与空白对照组比较，2、4、6 mg/kg Sit-S组小鼠的不动时间均显著缩短（P<0.05或P<0.01），而4 min内的活动次数差异均无统计学意义（P>0.05）。这提示，2、4、6 mg/kg剂量下，Sit-S具有较好的抗抑郁作用，并且不会影响小鼠的自主活动，其中以4 mg/kg剂量的效果最好，故本项目组后续选择此剂量进行作用机制研究。

2.7 Sit-S抗抑郁作用的机制研究

将剩余40只小鼠随机分为空白对照组（10%丙二醇溶液）、Sit-S组（4 mg/kg，以10%丙二醇溶液为溶剂制备）、荷包牡丹碱+Sit-S组[4 mg/kg荷包牡丹碱（竞争性GABA 拮抗剂）+4 mg/kg Sit-S]、阿戈美拉汀+Sit-S组[40 mg/kg阿戈美拉汀（5-HT和5-HT 2C受体拮抗剂）+4  mg/kg Sit-S]、氟哌啶醇+Sit-S组[0.2 mg/kg氟哌啶醇（非选择性D2受体拮抗剂）+4 mg/kg Sit-S]，每组8只。3种拮抗剂的给药剂量均按照临床成人用量换算而得。各组小鼠均腹腔注射给药，给药体积均为1.0 mL。给药60 min后，按“2.5”项下方法进行悬尾实验，测定其不动时间。悬尾实验结束后，将小鼠脱颈处死，于无菌操作台上取出其脑组织，用生理盐水冲洗干净，称质量，并加入约9倍体积（mL/g）的生理盐水，匀浆，然后以10 000  r/min离心10 min，取上清液，在-80 ℃条件下冻存，待测。采用ELISA法测定小鼠脑组织中5-HT、DA、GABA水平，具体操作严格按照相应试剂盒说明书进行。按照“2.5”项下方法进行数据的统计分析。各组小鼠不动时间和脑组织中5-HT、DA、GABA水平测定结果见表3。

结果显示，与空白对照组比较，Sit-S组小鼠的不动时间显著缩短（P<0.01），脑组织中5-HT、DA、GABA水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。与Sit-S组比较，3种抑制剂联用组小鼠的不动时间均有一定延长，其中阿戈美拉汀+Sit-S组、氟哌啶醇+Sit-S组的不动时间显著延长（P<0.05），并且阿戈美拉汀+Sit-S组的5-HT水平、氟哌啶醇+Sit-S组的DA水平和荷包牡丹碱+Sit-S组的GABA水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 讨论

本研究以百花花楸干燥成熟果实为材料，经过75%乙醇和20%KOH溶液提取，并经萃取、结晶得到了Sit。为提高Sit 的生物利用度和药理活性，本项目组对Sit进行了衍生化，最终得到了Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S等4种酯类衍生物，并通过NMR和IR法验证了各衍生物的结构。同时，采用悬尾实验和强迫游泳实验对Sit及其衍生物的抗抑郁活性进行了筛选。结果表明，Sit的水杨酸酯衍生物Sit-S（4 mg/kg）可显著缩短悬尾实验和强迫游泳实验中的小鼠不动时间，表现出优良的抗抑郁活性。此外，為了排除小鼠不动时间的减少是由于药物对其运动能力的影响所致，本研究还进行了小鼠自发运动能力测试实验，结果显示Sit-S不影响小鼠的自发活动。

5-HT不但可以与脑组织中的其他中枢神经相互作用，参与机体对外界刺激的适应和调节，而且也是情绪、睡眠和其他生理活动的重要调节因子，5-HT水平的增加对抑郁症的恢复具有积极的作用[19-21]。本研究发现，Sit-S给药后可明显升高小鼠脑组织中5-HT水平，但联用阿戈美拉汀（5-HT受体拮抗剂）后，可以有效逆转Sit-S的这种作用，表明Sit-S可通过5-HT途径发挥其抗抑郁作用。DA受体广泛分布于中枢神经系统中，其中D2受体是DA参与抑郁生物调控的重要物质，在抑郁症的发生和恢复中也起着至关重要的作用[22-24]。有研究表明，重症抑郁患者的下丘脑组织中DA含量极少，给予抗抑郁药物治疗后，其DA水平开始上调，同时功能也趋于正常[25]。本研究发现，给予Sit-S后可显著升高小鼠脑组织中DA水平，但联用氟哌啶醇（非选择性D2受体拮抗剂）后，能明显消除Sit-S的抗抑郁作用。该结果证实了Sit-S的抗抑郁作用是由D2受体的激活所引起的。GABA是神经元传递信息电路中重要的兴奋性神经递质，当其与GABA受体（GABARs）结合后，会促进电路中Cl-流出、Ca2+流入，从而强化神经元树突生长和突触发生，这一功能保证了细胞间兴奋性信息的成功传递[26-27]。因此，补充GABA含量可以有效减轻抑郁症。本研究发现，给予Sit-S后可显著升高小鼠脑组织中GABA水平，而联用荷包牡丹碱（抑制性神经递质 GABA拮抗剂）后，可一定程度上逆转Sit-S的抗抑郁作用，但是作用不显著。该结果提示Sit-S的抗抑郁样作用可能部分由GABA能系统介导的。

综上，本研究成功从百花花楸果实中分离、制备了Sit，并合成了4种酯类衍生物。其中，Sit与水杨酸经羧合反应得到的酯类衍生物Sit-S具有良好的抗抑郁活性，其作用机制可能是通过提高脑组织中5-HT、DA和GABA水平所介导的。

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