盐胁迫对15种乔木柳插条表型和生理指标影响
2021-01-26江钰娜吴瑜玮高俊峰冯志聪黄婧柯刘国元
江钰娜，方 威，吴瑜玮，高俊峰，冯志聪，黄婧柯，刘国元，张 健
(南通大学 生命科学学院观赏植物遗传育种重点实验室，江苏 南通 226019)
我国的盐碱地面积巨大，主要分布在西北和沿海地区[1]。其中江苏沿海滩涂面积超过1 000万亩，占全国滩涂面积的1/4以上[2]。盐害严重制约了农林业生产，对生态环境造成了巨大的威胁[3-4]。在改良滩涂盐碱地进程中，种植耐盐林木是一种投入成本低、效果比较好的手段[5]。
柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)和钻天柳属(Chosenia)树种的统称，分为乔木与灌木，亚洲是柳树的起源中心，仅我国就有275种。它树姿美观，是重要的园林观赏植物，不仅有速生、耐寒、耐旱与耐污染等优点，还有耐盐、保持水土的能力，是重要的用材及生物质能源树种[6]。围绕柳树的耐盐性，研究人员开展了许多工作，如季永华[7]选用12种杨树、柳树无性系进行田间扦插，分析树种生长指标与土壤含盐量相关性，结果表明树种成活率、保存率、生长量等均与土壤含盐量呈负相关，得出树木生长的耐盐量极限值。通过水培条件下盐胁迫5个优良柳树无性系，隋德宗[8]发现低盐浓度刺激了柳树的根系活力，随着盐浓度的增加，茎叶鲜重、叶片叶绿素含量、SOD逐渐降低，MDA、相对电导率、脯氨酸含量逐渐增加，并且指出盐处理28 d后的相对茎高和盐胁迫40 d后的叶绿素含量可作为早期鉴定柳树无性系耐盐性的形态指标和生理指标[8]。聂莉莉等[9]采用盆栽试验模拟低海拔地区柳树生长，结果发现：盐胁迫抑制了柳树地上部分和根的生长，金丝垂柳的耐盐能力高于旱柳。李敏[10]比较2个柳树亲本耐盐性，结果得出9901柳耐盐能力大于沿江柳。李晶等[11]设置4个耐盐梯度比较3种柳树耐盐性，结果得出耐盐能力强弱：109柳>青竹柳>329柳。田生昌等[12]比较盐柳1号在3种盐分处理下的株高和地径生长，发现该树种的生长存活率都很高，有较强的耐盐能力。柳树的耐盐能力与其植株表型、存活率、体内生理物质等多方面因素密切相关。当土壤的含盐量达到3‰，大部分植物都会受到伤害甚至难以生长，因此3‰含盐量为衡量植物耐盐程度的重要分界线[13-14]。我们采用水培法，用50 mmol·L-1NaCl(约等于3‰的盐浓度)对15个乔木柳品种进行盐处理，对其地上部分6个指标(萌芽期、叶片数、总萌枝数、总萌枝长、叶鲜干重、叶含水量)和地下部分6个指标(萌根期、最长根长、总根长、总根数、根鲜干重、根含水量)以及2个生理指标(根MDA含量、相对电导率)进行测定，拟通过多项表型指标和生理指标组合测定，较为全面了解盐胁迫下不同乔木柳品种地上和地下部位的盐响应表型以及生理指标差异，筛选出耐盐在临界值以上的乔木柳品种，为沿海滩涂防护林建设提供材料基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料采自南通大学生命科学学院植物园，15个品种分别为柳树优良无性系J2087(Salix×jiangsuensis‘J2087’)、柳树优良无性系J2187(Salix×jiangsuensis‘J2187’)、旱垂柳287(S.babylonica×S.matsudana‘287’)、苏柳795(Salix×jiangsuensis‘J795’)、苏柳172(Salix×jiangsuensis‘J172’)、苏柳932(Salix×jiangsuensis‘J932’)、金丝垂柳J1010(Salix×aureo-pendula‘J1010’)、苏柳799(Salix×jiangsuensis‘J799’)、龙爪柳(S.matsudanaf.tortuosa)、紫杆柳(S.wilsonii)、东营柳1号(S.matsudana‘DongYingliu-1’)、东营柳2号(S.matsudana‘DongYingliu-2’)、渤海柳1号(S.matsudana‘Bohai-1’)、盐柳1号(S.psammophila‘Yanliu-1’)和竹柳(S.matsudana‘Zhuliu’)。统一截取1年生8 cm长、3～5 mm粗的扦插条，在南通市观赏植物遗传育种重点实验室内的人工气候室进行水培试验，并测定不同表型与生理指标。
1.2 试验方法
由于3‰含盐量为植物耐盐程度的分界线，因此采用50 mmol·L-1NaCl(约等于3‰的盐浓度)进行盐胁迫，同时设清水作为CK。水培采用240 mL的塑料杯。每杯置100 mL溶液，扦插条每10根置于1个杯子作为1个处理，试验共设3次重复，人工气候室日照/黑暗12 h，光强3 000 lx，温度22℃±2℃，每3 d更换1次盐溶液同时测定数据，试验从10月14日开始至11月5日结束，共21 d。
1.3 生长指标的测量
试验过程中，从第3天开始统计其萌根期和萌芽期，第21天记录所有品种的最长根长、总根长、总生根数、叶片数、总萌枝数、总萌枝长，测定叶鲜重、叶干重、根鲜重、根干重。其中始根期、始芽期、总生根数、总萌枝数等指标，均采用目测，所有的长度指标通过直尺测量，干鲜重的测量采用数字天平，其中干重用烘箱65℃干燥直至恒重后测量。
1.4 生理指标的测定
丙二醛依据硫代巴比妥酸法用试剂盒测定；电导率测定方法：量取50 mL超纯水加入提前用超纯水润洗过的离心管中，称取0.15 g完整根系用纸吸干水分后，用超纯水漂洗1～2次，然后再吸干水分，并放入离心管，完全浸泡后2 h后测水的电导率。
1.5 数据处理
用Excel 2019、SPSS26软件和R语言进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 盐胁迫对乔木柳插条的生长指标的影响
盐胁迫下植株根系、地上部、生物量等多个生长指标都会受到抑制，比较不同时间盐处理对15个品种扦插条的影响，发现处理第21天时不同乔木柳品种扦插条受盐胁迫影响严重，枝条出现叶片发黄、枯萎，柳树根脱落、皱缩，且不同柳树品种间的表型区分明显。
2.1.1 盐胁迫对乔木柳插条的根、叶萌发时间的影响 由表1可知，盐胁迫下多数乔木柳的萌根、萌叶的时间普遍推迟。方差分析表明：盐处理下盐柳1号的萌根期提前，且与对照组差异显著，渤海柳1号、龙爪柳、东营柳2号、苏柳799这4个品种萌根期虽然提前但与对照组差异不显著，而J2087、J2187、东营柳1号等10个品种萌根期延迟且与对照组差异显著，从萌根期来看，受盐处理影响最大的是苏柳172，最小的是盐柳1号。盐柳1号比对照组提前了15.17%，说明盐处理显著可以促进盐柳1号的根萌发。柳树地下部分所吸收的水和养分会传输到地上部分以供给整株生长。观察叶萌发情况发现盐胁迫下J2087、苏柳799、287、苏柳172的叶萌发时间延迟且与对照组差异显著，而其余品种萌发时间虽有推迟但差异不显著。综上所述，50 mmol·L-1盐可促进盐柳1号生根，对苏柳172根、叶的萌发有较强的抑制作用。
表1 不同乔木柳品种的萌根期和萌芽期Table 1 Rooting period and starting shoot time of different arbor varieties
2.1.2 盐胁迫对乔木柳插条的根生长的影响 根长是根重要的表型指标，根长的增加说明根的活性良好。图1展示了15个乔木柳的最长根长、总生根数和总根长3个根生长指标数据。对照组的最长根长区间从4.75～8.55 cm，与对照组相比，处理组中增量(处理/对照)最大的是苏柳795，最小的是苏柳932(图1a)。处理组的总生根数是对照组的65%～240%，增量最大的是苏柳795，最小的是苏柳932(图1b)。处理组中总根长增量最大的是苏柳795，最小的是苏柳932(图1c)。结合方差分析，盐处理下，苏柳795的总生根数和总根长均显著高于CK。渤海柳1号和苏柳799的总生根数显著高于CK，而J2087、龙爪柳和苏柳932均有指标显著低于CK，苏柳795的根生长最强，苏柳932的根生长最弱。综上所述，50 mmol·L-1盐处理一定程度促进了苏柳795、渤海柳1号、苏柳799这3个品种的根生长，而对J2087、龙爪柳和苏柳932的根生长抑制较大。根据3个根生长指标的相关性分析(表2)，总根长与总生根数、最长根长相关性显著，总生根数与最长根长相关性不明显。
注：不同大写字母表示同一品种在处理组与对照组差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示不同品种之间的差异显著(P<0.05)。下同。图1 不同乔木柳品种的根生长情况Fig.1 Root growth of different arbor willow varieties
表2 最长根长、总生根数、总根长相关性分析Table 2 Correlation analysis of the longest root length,total root number,total root length
2.1.3 盐胁迫对乔木柳插条的萌枝生长的影响 图2反映的是15个柳树品种第21天的总萌枝数、总萌枝长和总叶片数。处理组的总萌枝数增量最多的是竹柳，最少的是苏柳172。竹柳、紫杆柳、盐柳1号、东营柳2号、渤海柳1号的总萌枝数在盐处理时增加(图2a)。处理组的总萌枝长增量最大的是苏柳799，最小的是J1010(图2b)。在15个品种中，对照组叶片数最多的是龙爪柳，最少的是J1010，处理组增量均<1(图2c)。方差分析表明：总萌枝长中J2187、龙爪柳、盐柳1号显著低于CK。总萌枝数中竹柳显著高于CK，J2187、苏柳795、苏柳172、苏柳799显著低于CK。总叶片数中J2087、J2187、287、苏柳795、苏柳799、龙爪柳显著低于CK。其余品种处理组差异不显著。说明50 mmol·L-1盐处理促进了竹柳的萌枝生长，抑制了J2187的萌枝生长，而对渤海柳1号、东营柳1号、东营柳2号、紫杆柳、J1010和苏柳932的萌枝生长影响较小。
图2 不同乔木柳品种的萌枝生长情况Fig.2 Growth of the shoots of different arbor willow varieties
2.1.4 盐胁迫对乔木柳插条的根、叶干鲜重的影响 生物量是盐胁迫下植株生长量最直接的反映结果。图3展示了不同乔木柳品种的根、叶干鲜重在盐处理和对照间的质量差异。通过对根鲜重的测定发现，对照组中最大的是苏柳799，最小的是紫杆柳，增量最大的是紫杆柳，最小的是苏柳932(图3a)；根干重对照组中最大的是苏柳799，最小的是紫杆柳，增量最大的是紫杆柳，最小的是东营柳2号(图3b)。对照组的叶鲜重中最大的是苏柳799，最小的是J1010，处理组中增量最大的是紫杆柳，最小的是J2187(图3c)；叶干重的对照组中最大的是渤海柳1号、紫杆柳，最小的是J1010，增量最大的渤海柳1号，最小的是苏柳932，在盐处理下叶干重均低于CK(图3d)。方差分析表明：苏柳932的根鲜重显著低于CK，苏柳799的根干重显著低于CK，其余品种在根的干鲜重与对照差异不显著。而与对照相比，各品种叶的干鲜重差异显著的较多，J2087、J2187、苏柳172、苏柳932、苏柳799、龙爪柳和竹柳的叶鲜重与对照差异显著，苏柳172、苏柳932、苏柳799、渤海柳1号、竹柳这5个品种的叶干重与对照组差异显著，说明50 mmol·L-1盐处理对所测的多数乔木柳品种的叶生物量影响较大，而对根生物量影响不大。
图3 不同乔木柳品种的根、叶干鲜重Fig.3 Dry weight and fresh weight of the roots and leaves of different arbor willow varieties
2.2 盐胁迫对乔木柳插条生理指标的影响
2.2.1 盐胁迫对乔木柳插条的丙二醛(MDA)的影响 盐胁迫会使活性氧(ROS)积累过多，进而造成氧化损伤，会损伤植物细胞膜系统，最终分解成丙二醛(MDA)等化合物，引起膜脂过氧化反应[15]，因此常以植物组织中MDA含量作为判断膜脂过氧化作用的主要指标。在试验中，测定了根的MDA含量(图4)，结果发现：与对照相比，J2087、287、苏柳932、龙爪柳、紫杆柳、东营柳2号、渤海柳1号等7个品种的MDA含量有所增加。方差分析表明：苏柳932的MDA含量显著高于CK，J1010的MDA含量显著低于CK，其余品种的处理组和对照组差异不显著，各品种间的MDA含量差异也不显著，说明50 mmol·L-1盐处理对15个乔木柳的细胞伤害不大。
图4 不同乔木柳品种的MDA含量Fig.4 MDA content of different arbor willow varieties
2.2.2 盐胁迫对乔木柳插条的根系质膜透性的影响 植物在受到盐胁迫时最先受到伤害的是根部，然后根组织的细胞膜受到伤害，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗，外渗的物质进入环境介质，根据浸泡根组织液的相对电导率可以判断根组织在有无盐处理下的破坏程度，从而反映柳树耐盐能力的强弱[16]。从图5看出，龙爪柳在盐处理下根相对电导率略有下降，而其他的乔木柳品种的相对电导率都增加。说明50 mmol·L-1盐处理对乔木柳的根质膜透性产生了一定的破坏影响。
图5 不同乔木柳品种的相对电导率Fig.5 Relative conductivity of different arbor willow varieties
2.3 乔木柳表型和生理指标的相关分析
将柳树地上部分和地下部分12个表型指标与2个生理指标的进行了相关分析，表明根系的MDA与总萌枝数呈极显著正相关，而其相对电导率与叶片数和叶干重呈极显著负相关(表3)。总萌枝数还与叶片数极显著正相关，叶片数与最长根长负相关。总萌枝长与始根期和始芽期负相关，与叶鲜重正相关。
表3 乔木柳生理和生长指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of physiology and growth index of arbor willow
2.4 15种乔木柳品种表型和生理指标聚类分析
用R语言中的“factoextra”软件包进行聚类分析，距离计算采用“euclidean”算法，并采用最长距离法(complete)对15个乔木柳品种的12个表型指标和2个生理指标进行层次聚类并绘图,可以分为3类(图6)。第1类有5种：盐柳1号、东营柳2号、竹柳、渤海柳1号、紫杆柳；第2类有4种：287、J2087、龙爪柳、苏柳932；第3类6种：苏柳795、J2187、苏柳172、东营柳1号、金丝垂柳J1010、苏柳799，表明第1类耐盐性较强，第2类耐盐性中等，第3类耐盐性较弱。
图6 乔木柳表型和生理指标的聚类分析Fig.6 Cluster analysis of phenotype and physiological index of arbor willow
3 结论与讨论
在50 mmol·L-1NaCl盐处理下，不同乔木柳盐响应迥异。结合地上部分和地下部分的12个生长表型指标和2个生理指标的聚类分析，得出盐柳1号、东营柳2号、竹柳、渤海柳1号、紫杆柳的耐盐性较强，287、J2087、龙爪柳、苏柳932的耐盐能力中等，苏柳795、J2187、苏柳172、东营柳1号、金丝垂柳J1010、苏柳799的耐盐能力较弱。
盐胁迫下，不同乔木柳品种的生长都受到了抑制。从地下和地上2部分生长分析，表型指标变化差异较大。其中盐柳1号的根萌发时间提前，苏柳795、渤海柳1号、苏柳799的总生根数、总根长和最长根长得到一定的增加，这与在其他柳树无性系、长穗偃麦草、油菜等植物在盐胁迫下的影响相一致，如隋德宗等[17]发现低盐浓度刺激柳树根系生长，在长穗偃麦草中发现低盐浓度对其胚根生长有一定的促进作用一致[18]，在油菜的盐处理试验中发现在随着盐浓度增加，油菜根长经历了先升高后降低的趋势[19]，这些都说明盐浓度较低时，植物根系受到一定刺激生长。在本研究中，我们还发现柳树的生理指标变化也不是一致的，已有研究表明，渗透调节、活性氧清除系统是盐胁迫响应的2个常见途径[20-22]，电导率是反映渗透调节的常用指标之一，在植物活性氧清除过程中，丙二醛含量、可溶性糖随着盐浓度增加而增加，过氧化物酶随着盐浓度先增加后减少，根部积累Na+影响根系生长，因盐胁迫减弱K+吸收[ 23-25]。试验中J2187、苏柳795、苏柳172、J1010、苏柳799、东营柳1号、盐柳1号和竹柳等8个品种的MDA含量比CK低，这与刘铎等[26]研究中发现盐柳1号在25 mmol·L-1和50 mmol·L-1盐浓度时MDA与对照相比有所下降一致，而庞元湘等[27]研究盐胁迫下“鲁柳1号”的生长发育情况发现，MDA的含量随着盐浓度的增加而增加，在7‰时达到最大，之后随着时间的延长而含量减少。在其他植物中，低盐浓度处理下不同品种的电导率和MDA含量也会出现减少的情况。赵锐明等[28]在比较2种黄芪幼苗耐盐性时发现盐处理下，蒙芪Z09-1相对电导率
相关性分析表明：总萌枝数与MDA正相关，叶片数和叶干重与相对电导率负相关。总萌枝数、叶片数可能与柳树插条耐盐性的表型鉴定有重要关系。总萌枝数可能与根系细胞膜损失程度有关，短期内，在盐浓度刺激下，植物组织内的活性氧积累开始增加，初期低浓度的活性氧不会对植物产生危害，反而能在植物细胞信号转导途径中充当第二信使来介导应答反应[30]，可能一定程度刺激了柳树萌枝数的生长，随着时间的推移，ROS过量则抑制柳树生长。叶片数和叶干重可能与细胞质膜透性有关，细胞膜受到盐浓度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗，这部分电解质包括盐类、有机酸等，根系的养分运输不到地上部分，叶片受损加重，出现萎蔫，枯败等现象，表现出叶片数和叶干重降低。表明盐胁迫下，根系的渗透调节可能主要与地上部叶片数、生物量等长期生长指标有关，而根系中活性氧含量可能主要在胁迫前期影响地上部萌芽数等前期性状。
在柳树耐盐机制中，渗透调节和抗氧化系统在不同品种里作用不同，这可能还有其他作用机制共同响应盐胁迫。本研究采用人工气候室恒温水培进行NaCl胁迫试验，方法简单快捷，研究结果可为了解不同柳树品种的耐盐性选定提供参考，另外生理指标多为应激指标和单一的表型指标均无法准确鉴定柳树品种间不同的耐盐能力，所以试验选用多种地上地下表型指标进行测定，为柳树耐盐性鉴定提供指标依据。
