牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的分离及其酶学性质

赵莉君 赵 珂 赵改名 马阳阳 朱瑶迪 李苗云 黄明远

(1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.舞钢市防震减灾中心，河南 舞钢 462599)

冷鲜牛肉营养丰富，味道鲜美，在满足人们对美食需求的同时，给人体健康带来诸多益处，是牛肉消费的主要形式[1-2]。然而，冷鲜牛肉在运输和贮藏过程中出现的颜色劣变问题极大程度地影响了其销售，制约了其发展。研究[3-5]表明，影响冷鲜牛肉色泽稳定性的因素包括品种、部位、温度、pH、脂质过氧化、微生物、肌红蛋白的状态及高铁肌红蛋白还原酶的活性等。其中，氧合肌红蛋白呈鲜红色，高铁肌红蛋白呈棕褐色，肌细胞内部存在的高铁肌红蛋白还原酶能将高铁肌红蛋白还原成氧合肌红蛋白，从而稳定肉色，延长其货架期[5-7]。就不同部位冷鲜肉而言，贮藏过程中，背最长肌的色泽稳定性相对较好。

近年来，有关高铁肌红蛋白还原酶的研究报道较多，但涉及其分离纯化和性质研究的相对较少。研究[8-10]表明，不同种类的肉、同一种类不同部位的肉，高铁肌红蛋白还原酶间存在差异。试验拟以冷鲜牛背最长肌为原料，采用硫酸铵盐析、超滤的方法，对其高铁肌红蛋白还原酶进行粗分离，并对高铁肌红蛋白还原酶的适宜温度、pH等进行研究，以期为冷鲜牛肉色泽稳定性的提高提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牛背最长肌：夏南牛，郑州市天明路黄家牛肉超市；

透析袋：截留分子量10 kDa，北京博奥拓达科技有限公司；

超滤膜：分子量50，30，10 kDa，上海摩速科学器材有限公司；

马骨骼肌肌红蛋白标准品：北京索莱宝科技有限公司；

硫酸铵、磷酸、铁氰化钾等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：AL104型，梅特勒—托利多(上海)有限公司；

台式冷冻离心机：Multifuge X1R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

恒温水浴锅：HH-601A型，金坛市国旺实验仪器厂；

超滤杯：MILLIPORE 8050型，上海摩速科学器材有限公司；

磁力搅拌器：JB-1A型，上海雷磁仪器厂；

电泳仪：DYY-5型，北京六一仪器厂；

紫外检测仪：HD-21-2型，上海青浦沪西仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 高铁肌红蛋白还原酶粗酶液的提取 参照高娜等[11-12]的方法并稍作改进。肉样切小块去筋膜，搅碎。每组取5 g样品并加入20 mL磷酸缓冲液。经高速分散器匀浆处理后，4 ℃、10 000 r/min离心20 min，上清液用中速定性滤纸过滤掉多余脂肪。用稍过量的铁氰化钾(3.0 mmol/L)氧化滤液中的氧合肌红蛋白，至滤液由鲜红色变为褐色。将滤液装入分子量10 kDa 的透析袋，于磷酸缓冲液中透析除盐24 h(每5 h换一次透析液)，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，取上清液，用磷酸缓冲液定容至25 mL，即制得粗酶液。

1.2.2 高铁肌红蛋白还原酶酶活性的测定 参照文献[6,11-12]的方法并稍作改进。反应温度25 ℃，反应前25 min将各组分放置于25 ℃水浴锅中水浴加热。加入还原型辅酶Ⅰ后，启动反应，测定580 nm处吸光值，每隔10 s记录一次数据。

1.2.3 硫酸铵盐析 参照文献[13]的方法并稍作改进。取粗酶液，边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至55%饱和度，磁力搅拌20 min，冰浴静置2 h，4 ℃、10 000 r/min离心20 min；取上清液，边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末至60%饱和度，重复上述操作，最终得到粗酶液在55%，60%，65%，70%的硫酸铵饱和度下的分级沉淀物；将沉淀分别溶于磷酸缓冲液，于4 ℃充分透析脱盐，测定蛋白含量和高铁肌红蛋白还原酶酶活。

1.2.4 超滤 参照文献[13]的方法并稍作改进。在1.2.3的基础上，将具有高活性高铁肌红蛋白酶活的目标样液用微孔滤膜(0.45 μm)过滤去除不溶性杂质，将滤液加冰磷酸盐缓冲液(2.0 mmol/L，pH 7.0)稀释，于氮气压力1.0 MPa，120 r/min下分别用50，30，10 kDa膜进行超滤，测定蛋白含量和高铁肌红蛋白还原酶酶活。

1.2.5 蛋白质含量的测定 采用Bradford法[13]。取5 mL 过滤后的考马斯亮蓝染液，加入待测样液1 mL，5 min 后测定595 nm处吸光度，并将其代入标准曲线计算蛋白质浓度。

1.2.6 SDS-PAGE电泳 参照SDS-PAGE电泳标准操作流程[13]。其中，使用5%浓缩胶和12%分离胶，Marker的分子量为6.5～200.0 kDa，对MetMbR酶的粗提取液及各纯化阶段酶液进行SDS-PAGE电泳试验。

1.2.7 适宜温度、pH等的测定

(1) 最适温度：按1.2.2的方法将整个反应体系组分分别置于20，30，40，50 ℃下反应，测定高铁肌红蛋白还原酶活性。

(2) 最适pH：按1.2.2的方法将整个反应体系组分分别于pH 5.0，6.0，7.0，8.0下反应，测定高铁肌红蛋白还原酶活性活。

(3) 金属离子：按1.2.2的方法在反应体系中分别以不同离子浓度(0.5，1.0，5.0 mmol/L)的Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+金属离子替代EDTA，同时以去离子水作为空白对照，测定不同金属离子下高铁肌红蛋白还原酶活性变化。

1.2.8 数据处理 采用Excel 2010和SPSS 16.0软件对试验数据进行整理和分析。

2 结果与分析

2.1 牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的粗分离

2.1.1 硫酸铵盐析 夏南牛牛背最长肌粗酶液中高铁肌红蛋白还原酶的酶活为(89.0±1.4) U/mL。硫酸铵盐析法常用来进行酶的粗分离，其操作简便，效果好[14]。由表1 可知，当硫酸铵饱和度为65%时，高铁肌红蛋白还原酶活性较高，即当硫酸铵饱和度为65%时，可主要沉淀得到高铁肌红蛋白还原酶，实现粗分离。

2.1.2 超滤 超滤是常用的膜分离技术之一，其以压差为推动力，根据超滤膜截留分子量的不同，可用于对酶的粗分离与纯化[15]。由表2可知，>50 kDa超滤膜截留液中所获得的高铁肌红蛋白还原酶活性较高，可取该部分经粗分离与纯化的截留液进行后续分析。

表1 不同硫酸铵饱和度下牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活Table 1 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different ammonium sulfate saturation

由表3可知，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶经硫酸铵盐析、超滤后，得到了一定程度的粗分离与纯化。

2.1.3 SDS-PAGE电泳 由图1可知，牛背最长肌粗酶液中的蛋白分子量为14.3～97.2 kDa，经硫酸铵盐析、超滤初分离后，提取物中的蛋白分子量为29.0～66.4 kDa。经硫酸铵盐析、超滤后，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶虽得到了部分分离与纯化，但粗酶液中还含有大量其他杂蛋白。若需对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶进行进一步细分离与纯化，还需通过凝胶过滤层析或离子交换层析、亲和层析等技术得以实现[16-17]。

表2 不同超滤截留液中牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活Table 2 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different ultrafiltration

表3 分步提取物中牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活Table 3 The metmyoglobin reductase activity of longissimus muscle under different purification

M.Marker 1.粗酶液 2.65%硫酸铵盐析 3.>50 kDa超滤图1 SDS-PAGE电泳图Figure 1 SDS-PAGE electrophoretogram

2.2 牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的酶学性质

2.2.1 最适温度 由表4可知，温度对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性影响显著(P<0.05)，随着温度的升高，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性先上升后下降。当温度为40 ℃时，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性最高。Mikkelsen等[18]发现牛心肌高铁肌红蛋白还原酶活性随温度的升高而升高，直至温度为30 ℃；Eehevarne等[19]发现牛骨骼肌高铁肌红蛋白还原酶最适温度为37.5 ℃，且当温度为10 ℃以下和50 ℃以上时活性极小。综上，温度对高铁肌红蛋白还原酶活性有较大影响。

2.2.2 最适pH 由表5可知，pH对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性影响显著(P<0.05)，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性的适宜pH为6.0。Hagler等[8]发现牛心肌中MetMbR的最适pH为6.5，高娜等[11]研究表明牦牛背最长肌在pH 7.0时MetMbR酶活最高，Zhu等[20]也发现pH值对MetMbR的还原作用影响显著。

表4 温度对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活的影响†Table 4 Effect of temperature on the metmyoglobin reductase activity

表5 pH对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活的影响†Table 5 Effect of pH on the metmyoglobin reductase activity

2.2.3 金属离子 由表6可知，5种金属离子(Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+)对高铁肌红蛋白还原酶酶活呈抑制作用，其中Cu2+的抑制作用尤为明显，与王玮[9]的研究结论一致。

表6 金属离子对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活的影响†Table 6 Effect of metal ions on the metmyoglobin reductase activity

3 结论

对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶进行了粗分离。结果表明，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶酶活为89.0 U/mL。经硫酸铵盐析(硫酸铵饱和度为65%)、超滤(>50 kDa)，可使得牛背最长肌中高铁肌红蛋白还原酶实现粗分离。SDS-PAGE电泳表明，牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶的纯化效果并不理想，若要得到电泳纯的高铁肌红蛋白还原酶，还需在后续研究中通过凝胶过滤层析、离子交换层析或亲和层析等技术实现。粗分离所得的牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶分子量为29.0～66.4 kDa，最适温度为40 ℃，最适pH为6.0。此外，金属离子(Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+)对牛背最长肌高铁肌红蛋白还原酶活性有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最明显。