菌丝霉素分泌型丁酸梭菌防治罗非鱼链球菌病的应用研究

赵培静， 曹 丁#， 陈勉华， 张玲华， 明飞平， 梁倩怡， 夏枫耿

（1.广州市微生物研究所有限公司，广东广州 510663；2.华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642）

随着罗非鱼高密度集约化养殖的发展，其发病率越来越高，其中链球菌病防治难度较大，对罗非鱼养殖造成了重大威胁，己成为罗非鱼养殖可持续发展的最主要制约因素（陈福艳等，2019）。该病传播快，致死率高，链球菌病爆发往往与水质恶化、养殖密度过高等有关（刘忠强等，2016）。到目前为止，对控制链球菌引起的罗非鱼链球菌病仍缺乏安全高效的药物。

抗菌肽菌丝霉素是一种新型真菌源抗菌肽，可克服抗生素类药物在罗非鱼链球菌病防治中存在的缺陷，具有良好的研究前景（Ryuichiro等，2019）。体外抗菌活性试验显示，其对革兰氏阳性菌肺炎链球菌有显著的抑菌活性，而同时又能促进细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬活性，刺激免疫应答，提高抗体水平，增强抗病能力（杨雅麟，2009）。

丁酸梭菌具有抑制肠道有害细菌和促进肠道有益菌群增殖的双重作用，从而维持肠道的正常微生态平衡（Kanai等，2015）。临床研究表明，丁酸梭菌能够增强动物的免疫力，其发酵动物饲料能降低饲料中的抗营养因子，从而改善动物的生产性能和产品质量，减少抗生素用量，提高经济效益（Liao等，2015）。

丁酸梭菌作为农业部批准使用的动物饲料添加剂益生菌株，可减少抗生素的使用所引起的抗药性、二重感染等（张善亭等，2013）。本研究前期已将抗菌肽菌丝霉素序列克隆入表达载体pMTL82151中，并整合入丁酸梭菌，构建并筛选出一株能高水平分泌表达菌丝霉素的丁酸梭菌工程菌株，并对其发酵工艺和制剂制备进行了优化研究。在此基础上，本试验对抗菌肽菌丝霉素分泌型丁酸梭菌制剂进行抑菌活性稳定性和在罗非鱼不同养殖时期防治链球菌病的应用技术进行研究，计划将此丁酸梭菌作为抗生素的替代品，以实现肠道内定植、防病治病、提高罗非鱼水产品品质的目的，以及提供无毒副作用、无耐药性、无残留、低成本、效果显著的功能型微生物制剂。

1 材料与方法

1.1 供试菌 产菌丝霉素的丁酸梭菌工程菌株、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、猪链球菌由广东省微生物种质资源库保存。

1.2 主要试剂及培养基 种子培养基：葡萄糖25 g/L，酵母浸膏 20 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，硫酸铵1.5 g/L，碳酸氢钠1.5 g/L，一水合硫酸锰0.23g/L，七水合硫酸镁0.24 g/L，氯化钙0.02 g/L，初始pH为6.5。发酵培养基：葡萄糖20 g/L，豆饼粉提取液40 g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸氢钠1 g/L，玉米浆3 g/L，一水合硫酸锰0.2 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，氯化钙0.02 g/L，初始pH为6.5。抑菌活性检测培养基：氯化钠 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L ，葡萄糖 5 g/L，琼脂粉 2 0 g/L，PH 为 7.0。酵母抽提物，胰蛋白胨：英国 Oxoid公司；琼脂粉：广州环凯生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备 厌氧培养箱，生化培养箱，DHZ-DA大容量全温振荡器，752N型紫外可见分光光度计，50、500、5000 L 不锈钢发酵罐，压力喷雾干燥机，显微镜，电子天平，pH计等。

1.4 丁酸梭菌的发酵培养 将实验室保存的丁酸梭菌菌株转接于种子培养基中，液体试管深层静置培养，37℃厌氧静置培养24 h，按照5%的接种量加入种子培养基于平底烧瓶中，37℃厌氧培养24 h。然后以8%的接种量接种于50 L发酵罐中，并经过500、5000 L发酵逐级扩大培养，至稳定期后期结束培养，培养过程分别取样检测各种生理指标。

1.5 丁酸梭菌菌剂的制备 将一定比例的保护剂加入待干燥的丁酸梭菌发酵液中，采用压力喷雾干燥塔。进风流量保持在40000 m3/h，高压泵压力为10～15 MPa。首先设置喷雾干燥器的进风温度，然后开机预热，当塔内进口温度达到设定温度时，开启高压泵和喷枪，将料液以一定的流速泵入喷雾塔中，以此来控制出风温度。干粉储存于旋风分离器下收集袋中，将干粉收集密封于室温干燥阴凉处保存。

1.6 产菌丝霉素丁酸梭菌的抑菌活性测定 称取1 g粉末溶解于9 mL pH 6.0的PBS缓冲液中，离心取上清，采用标准琼脂孔穴扩散法，用不同的致病菌作为指示菌，加入固体检测培养基中，制备效价平板，用2.7 mm直径的打孔器打孔，每孔加样品5 μL，以菌丝霉素标准样作为对照，在合适的温度条件下培养一定时间后，观察抑菌圈的产生情况。

1.7 丁酸梭菌制剂的稳态化研究 将丁酸梭菌喷雾干燥粉末制剂，分别添加适量的米糠、豆粕、沸石粉，使菌丝霉素分泌菌株芽孢数为108cfu/g，以辅美粉稀释组作为对照，分为3组，每组3个平行，分别于室温放置三个月、半年、一年，检测丁酸梭菌活菌数和Plectasin含量。

1.8 菌体浓度的测定 高层半固体琼脂试管计数法：用移液管取1 mL菌液加到 9 mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅匀，不要有气泡，依次进行10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，每个稀释度作3个平行，37℃厌氧培养36 h，记录生长活菌数。

1.9 菌丝霉素含量的测定 将丁酸梭菌制剂溶解于磷酸缓冲液中，取适量的离心上清并稀释至合适的倍数，以浓度为300 μg/mL的菌丝霉素蛋白为标准品。然后加入5 mL考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，5 min后于595 nm测定光吸收值。以1 mL双蒸水及加5 mL考马斯亮蓝试剂作为空白对照。

1.10 丁酸梭菌菌剂对罗非鱼链球菌病防治效果测定 试验鱼为阳江罗非鱼良种基地自行繁育的吉富罗非鱼幼鱼，体重为3 g左右，选择无病无伤、活力强的个体作为试验用鱼。试验前在网箱中暂养 10 d，池塘水温为（35±2）℃，自然光周期。 暂养期间用增氧机不间断增氧，每天8：00和16：00各投喂浮性饲料1次（粗蛋白质为27%～30.0%、脂肪4%～5.5%），投喂量为体重的8%～10%。

本次试验共分为7组，在2 m×2 m×1 m的网箱中进行，在同一水塘中搭建7个同等规格的网箱，水深为0.8 m，试验间的平均水温为35℃。对照组饲喂基础日粮，试验组使用菌剂为菌含量为5×108cfu/g的菌丝霉素分泌型丁酸梭菌菌剂，根据拌料的剂量进行分组，每吨分别加菌剂50、100、150、200、250、300 g， 预防性的每周 2 次拌料；在整个养殖期间均施用该菌剂，各组随机分配，每组50尾，试验期60 d。养殖期间若发现死鱼及时捞出并解剖记录，分析死亡原因，并记录观察罗非鱼在试验期的健康状况。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌分泌菌丝霉素的抑菌活性测定用标准琼脂孔穴扩散法测丁酸梭菌工程菌分泌产物菌丝霉素的抑菌活性，发现菌丝霉素对以下10个代表性致病菌均有抑菌活性。其中，对条件致病菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、绿脓杆菌、黄单胞菌、巨大芽孢杆菌、沙门氏菌有较强的抑菌活性，抑菌圈直径为9～12 mm；对猪链球菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的杀菌效果次之，抑菌圈直径为7～9 mm，且抑菌圈边缘清晰，效果明显；显示出丁酸梭菌分泌的基因重组抗菌物质菌丝霉素具有较为广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌或阴性菌均有较好的抗菌效果。抑菌效果如表1。

表1 菌丝霉素对致病菌的抑菌效果mm

2.2 丁酸梭菌制剂的稳态化研究 从表2可看出，丁酸梭菌粉末制剂在室温存放0～12个月，其菌丝霉素均没有明显下降，说明丁酸梭菌粉末制剂中抗菌肽成分可以在室温条件下进行长时间的保存。丁酸梭菌制剂在室温存放三个月，米糠组其活菌数没有明显下降，其他组略有下降，随着保存时间的延长，各组均出现了不同程度的下降，其中米糠组活菌数下降较少，就保护效果来看，米糠对丁酸梭菌活菌数稳定性最好，豆粕粉和沸石粉次之，辅美粉对照组活菌数下降最多，因此选择米糠作为菌丝霉素菌株的缓释保护剂载体，可在常温保存一年。

表2 保存时间对丁酸梭菌制剂稳定性的影响

2.3 丁酸梭菌制剂防治罗非鱼链球菌病的使用剂量研究 由表3可以看出，随着丁酸梭菌剂量的提高，发病率明显下降，而 200、250、300 g/t添加组发病率接近，从成本考虑，丁酸梭菌添加量选用200 g/t添加组进行下一步试验，即菌丝霉素菌剂 5×108cfu/g，每吨加菌剂 200 g。

表3 菌丝霉素菌剂不同剂量防治罗非鱼链球菌病效果%

2.4 丁酸梭菌制剂防治罗非鱼链球菌病的使用频率研究 根据上步试验，选用菌丝霉素分泌型丁酸梭菌复配菌剂5×108cfu/g，每吨加菌剂200 g，分别按照预防性的两周一次拌料，每周一次、二次、三次、四次、五次拌料，分为6组，对照组饲喂基础日粮，饲养方法同上。

从表4数据可看出，随着加入丁酸梭菌制剂次数的增多，罗非鱼链球菌病发病率有下降的趋势，每周拌料2～3次以上，发病率接近，因此从经济成本考虑，建议每周拌料2次。

由表3、4可知，随着丁酸梭菌使用频率的降低，预防效果在显著下降，说明菌丝霉素菌剂可显著预防链球菌感染。因此选用菌丝霉素菌剂5×108cfu/g，每吨拌200 g，预防性的每周2次拌料，可显著降低罗非鱼链球菌病发病率。

表4 菌丝霉素菌剂不同使用频率防治罗非鱼链球菌病效果%

2.5 丁酸梭菌制剂防治罗非鱼链球菌病的使用阶段研究 为进一步降低养殖成本，方便推广应用，进一步明确是否要整个养殖期间均施用该菌剂，试验选取罗非鱼生长不同阶段如幼苗期和成长期分别施用该菌剂，检测其使用效果。

从表5可知，在罗非鱼养殖的特定阶段，在养殖饲料中添加丁酸梭菌均有降低链球菌病发病率的效果；其中，全程使用菌丝霉素菌剂效果最好，发病率最低，可降低发病率58.6%，而单独在某个生长期使用，虽然有一定防效，但效果不如全程使用。

表5 不同养殖期间使用菌丝霉素菌剂防治罗非鱼链球菌病效果%

3 结论与讨论

本研究对抗菌肽菌丝霉素分泌型丁酸梭菌制剂进行了抑菌活性、稳定性和罗非鱼养殖应用研究，发现此表达产物抗菌肽对常见致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和猪链球菌均有较好的抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌率为68.74%。选用米糠作为菌丝霉素分泌型丁酸梭菌的缓释保护剂载体，此制剂可在常温保存一年。通过上述的应用基础试验，初步建立一套菌丝霉素分泌型丁酸梭菌制剂养殖应用方案，用法用量为在罗非鱼饲养全程，选用菌丝霉素菌剂5×108cfu/g，每吨的饲料拌料添加丁酸梭菌制剂200 g，预防性的每周2次拌料，可显著降低罗非鱼链球菌病发病率58.6%以上。

诸多研究证实丁酸梭菌制剂能调节动物肠道微生态平衡，防治相关动物疾病，提高动物生产性能和产品质量，有效地减少抗生素引起的二重感染和动物体内的药物残留（易中华，2012），但目前丁酸梭菌制剂还未被普遍的作为益生菌剂添加于动物饲料。孙梅等（2011）采用微胶囊化包埋丁酸梭菌，显著提高了丁酸梭菌作为饲料添加剂的使用效果，为丁酸梭菌的广泛应用奠定了基础。

罗非鱼是主要的水产品出口品种，对我国的农业国际贸易极其重要，罗非鱼链球菌病的爆发，渔农频繁使用一些违禁药物，对我国水产品的质量安全造成极大威胁（苏友禄等，2019）。本研究开发的抗罗非鱼链球菌病菌丝霉素分泌型丁酸梭菌剂，可实现在丁酸梭菌中高水平分泌表达菌丝霉素蛋白，将抗菌肽的广谱抗菌作用和益生菌的保健功能结合起来，此协同作用有望克服单一微生态制剂存在的作用单一、质量不稳定、成本高、杀菌效果不如抗生素等缺陷（田木，2015）。此制剂作为生物防治罗非鱼链球菌病的高效活菌制剂，具有防治罗非鱼链球菌病发生和促进罗非鱼生长的作用，而且能大大降低化学药物的使用量，同时对于减少养殖水体有害物质的积累和保证农产品的质量安全又具有积极的作用，因此本产品具有较好的推广应用和市场化前景（李俊等，2019）。