枯草芽孢杆菌表达系统研究进展

马平英，罗 雯，詹怡昕，吴楚楚，熊雨顺，许小群，陈 梅

(南昌师范学院生物系，330032，南昌)

0 引言

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种理想型的模式生物，其应用价值很高，培养简单快速，具有非致病性及良好的发酵基础和生产技术等优势，是目前生产各种工业用酶的理想表达宿主。但是目前，枯草芽孢杆菌表达系统仍然存在不完善的地方。本文主要介绍了枯草芽孢杆菌表达系统的发展和应用进展，旨在为枯草芽孢杆菌表达系统研究提供参考。

1 枯草芽孢杆菌的优点

枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性短杆菌，有鞭毛，进行依赖性运动，其运动细胞更易形成菌膜[1]。该菌耐热，在土壤和腐败的有机物中易于生存，且不含有外毒素和内毒素，在工业生产和制药中被认为是一种安全的细菌[2]。并且一直被认为可生产复杂的环状脂肽，包括表面活性素、伊图林和丰霉素等，这些脂肽是很强的表面活性剂并具有抗菌活性，可应用于农业和医学领域[3-5]。又因枯草芽孢杆菌生长发育迅速,能在廉价碳源中良好生长，易于生存繁衍，可分泌多种营养物质，具有优良的发酵基础[6]，且能抑制多种菌类的生长，预示着其未来具有许多潜在的用途[7]。现已揭示了枯草芽孢杆菌中存在的大量调控相互作用和2个转录组学数据集，因此可以通过网络成分分析以及模型选择综合分析转录因子活性并揭示转录调控网络[8]。此外还发现了枯草芽孢杆菌中存在的整合与接合因子(ICEs)能促进水平基因转移，这种转移所具有的不相容性为转移元件及其宿主细胞提供了选择优势[9]。

2 枯草芽孢杆菌表达系统的发展

一直以来，枯草芽孢杆菌都被用作生产与分泌工业相关酶的宿主。国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有上百年的历史，早期工作主要是分离鉴定、形态观察以及各种功能的鉴定，目前的研究重心逐渐转移到遗传学与分子生物学领域。从环境和健康等角度出发，系统地了解革兰氏阳性细菌至关重要，KOO[10]等构建了枯草芽孢杆菌的2个单基因缺失文库，据此分析获得了一系列功能基因，并提供了一套高通量表型分析方法，为研究革兰氏阳性细菌的基因功能、代谢途径以及调控网络提供了丰富资源。

目前提高枯草芽孢杆菌转化效率的方法主要有3种，一是利用多聚体质粒进行转化；二是电穿孔法；三是原生质法。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌感受态细胞的转化更难实现，研究者从不同角度就如何提高转化效率进行了探索。YOKOI[11]等人设计了在2个不同受体菌之间实现基因传递的RK2系统，并优化了从大肠杆菌到枯草芽孢杆菌的基因传递。已有研究证明枯草芽孢杆菌的天然感受态菌株可以摄取多个不同的DNA分子，YE[12]等人基于这种现象设计并构建了枯草芽孢杆菌的未标记突变体，通过筛选对壮观霉素具有抗性的pUS20转化子来获得靶突变，这种方法能够以大约30%的频率传递点突变。NADLER[13]等人利用宿主天然的感受性以及同源重组能力开发了一种异源基因表达调控的自动化系统，有效克服易形成包涵体、毒性基因剂量效应或无法达到代谢工程所需水平等弊端，实现了高效转化及表达。这种方法适用性较广，对DNA的机械损伤微乎其微。ZHAO[14]等人使用含有反向选择标记mazF的枯草芽孢杆菌，成功构建了一个具有高转化效率、高阳性率且操作简便的新型质粒种间转移系统，为芽孢杆菌的遗传操作提供了一个新的方法。

基于枯草芽孢杆菌在生产重组蛋白中所起的重要作用，如何提高表达效率一直备受关注。TRAN[15]等人构建了在没有LacI阻遏物的情况下使用IPTG诱导启动子的无诱导表达质粒，并在枯草芽孢杆菌中实现了高效非诱导性表达，表达水平是诱导表达的37倍，该表达载体既可用于小规模基因表达的研究，也可用于大规模重组蛋白的生产。MARIAN[16]等利用基因工程手段开发了无标记基因缺失系统，用于优化枯草芽孢杆菌对蛋白质和低分子量物质。FU[17]等人利用包含不同信号肽的文库DNA直接转化枯草芽孢杆菌，对枯草芽孢杆菌分泌异源蛋白的最佳信号肽进行了系统筛选，显著提高了AmyS的产量。而GILBERT[18]等则利用枯草芽孢杆菌分泌表达的特点，设计开发了SpyTag-SpyCatcher系统，实现细胞外的蛋白质-蛋白质结合，利用细胞外自组装的优势为蛋白质结合提供了一种新的灵活策略。RUANGURAI[19]等人将来自食品级植物乳杆菌BCC9546的天然质粒用作载体，基于高效组成型启动子和信号肽的运用，在重组枯草芽孢杆菌中实现了淀粉酶的高效分泌型表达。结果表明谷氨酰胺ABC转运蛋白的信号肽在必需氨基酸转运中发挥作用，在开发有效的异源蛋白分泌表达系统中具有潜在的用途。

3 枯草芽孢杆菌表达系统应用进展

枯草芽孢杆菌的研究无论在理论还是产品应用开发等方面均已取得巨大成功，如工业发酵、传统发酵食品制备和植物病害生物防治等。

3.1 枯草芽孢杆菌在工业上的应用

枯草芽孢杆菌培养成本低、耗费时间少且有利于环境，是一种重要的表达宿主，既是有益菌，又是表达外源蛋白的工具[20]，已广泛用于合成生物学、代谢工程和工业酶的生产[21]。ZHOU等通过优化表达条件，实现了β-甘露聚糖酶(BcManA)在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，细胞外BcManA产量达到6 041 U/mL，是迄今为止通过摇瓶培养获得的最高产量，大大降低了该酶的生产成本[22]。重组枯草芽孢杆菌的发酵能力强，在大规模发酵中表现出特有的潜力，通过对发酵条件进行优化，已证明枯草芽孢杆菌WB600可以作为生产BglTO的合适宿主，其产物活性与已有商业酶相比更高效，有望在酿造工业中应用[23]。此外，胰蛋白酶[24]、转谷氨酰胺酶(MTG)[25]、有机溶剂耐受蛋白酶(OSP)[26]、杜纳糖[27]等多种工业产品均已成功在枯草芽孢杆菌中表达。

3.2 枯草芽孢杆菌在农业上的应用

枯草芽孢杆菌对人类是安全的，被界定为“GRAS”(Generally Recognized as Safe)，其在工业生产、疫苗开发、环境保护和肽库构建中都起到重要作用[28-29]。将枯草芽孢杆菌MF497446施用到受镉(Cd)污染的土壤中，可促进植物生长并消除(或至少减少)农作物中Cd的积累，确保食品安全，降低人类健康风险[30-31]。作为安全宿主，在枯草芽孢杆菌168中通过表达GGT(γ-谷氨酰转肽酶)可以提高茶氨酸的产量[32]。

3.3 枯草芽孢杆菌在医学上的应用

曲霉二糖在食品和医药领域中具有广泛的应用前景，但却无法大规模分离和提取曲霉二糖，而蔗糖磷酸化酶(SPase)可用于生产曲二糖，由于枯草芽孢杆菌一般被认为是安全的生物，WANG[33]等人首次在食品级枯草芽孢杆菌菌株中异源表达出了青春双歧杆菌SPase，这为大规模制备曲二糖提供了基础。芽孢的表达系统具有许多优点，包括安全性高、抵抗力高、成本低以及易制备，军事科学研究院化学防御研究所宋天宇[34]等人构建表达有机磷水解酶和脱水酶的重组芽孢，结果显示芽孢展示可能有助于有机磷降解酶的实际应用，并提供了有望降解有机磷化合物的生物修复方案。枯草芽孢杆菌在生产具有药理活性的重组蛋白方面具有多种优势，如质量和效率、安全性和分泌能力等，因此优于大肠杆菌。MAHDI[35]等人检验了将TPD(生物合成特立帕肽)以标签融合形式表达和分泌到枯草芽孢杆菌外的可行性，SDS-PAGE和western blotting结果表明，hPTH(人甲状旁腺激素)融合重组体成功表达并分泌到细胞外培养基中。抗菌肽由于其很少甚至是不会产生耐药性，同时不会在机体内残留得到科学家们的关注。PR-FO是一种新型的α-螺旋混合抗菌肽，具有较强的抗菌活性和较高的稳定性，具有发展成为新一代抗菌药物的潜力。ZHANG[36]等人在枯草杆菌WB800N中成功表达了重组PR-FO，表达产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较高的抑制活性，对人红细胞的溶血活性较低。枯草芽孢杆菌是一种具有益生菌特性的内生孢子和生物膜形成细菌，其芽孢具有独特的物理、化学以及生化特性，是口服疫苗递送的强大平台。通过构建一系列重组枯草芽孢杆菌菌株，测试了口服芽孢后狗的免疫应答能力，并据此建立了枯草芽孢杆菌用作肠道疫苗制剂的主要步骤[37]。研究也已证明枯草芽孢杆菌芽孢的口服递送可抵抗草鱼呼肠孤病毒感染[38]。

4 小结和展望

相比枯草芽孢杆菌而言，大肠杆菌仍然是药物蛋白工业生产中最常用的宿主，因其较易实现遗传转化，依然是药物开发项目先导阶段的首选。相比之下，芽孢杆菌的使用还存在一些问题，例如缺乏合适的表达载体、质粒不稳定性、易发生蛋白质折叠错误等。

如今，枯草芽孢杆菌的完整基因组序列是已知的，未知基因的功能也已得到研究。基因组学和蛋白质组学等现代技术的广泛应用，为进一步优化已经存在的枯草芽孢杆菌生产菌株铺平了道路。随着生物技术的发展，枯草芽孢杆菌底盘细胞的潜力也逐渐被揭示[39]。枯草芽孢杆菌是科学研究中的重要模式菌种，是一种具有极高研发潜力的微生物，其安全系数高、对环境无污染、高效且应用广泛，现已逐渐发展成生物技术领域的热点。随着基础研究和应用技术更深入的研究和推进，未来枯草芽孢杆菌将成为一个超级分泌细胞工厂[40]。