荧光显微技术与生命科学发现

卫红萍 任衍钢

（阳泉师范高等专科学校 山西阳泉 045200）

显微成像技术的发展是生命科学的重要驱动力之一，其中，荧光显微技术扮演着及其重要的角色[1]。依据2009 年《自然细胞生物学》（Nature Cell Biology）刊出《光学显微镜发展里程碑》的21项突破性进展中，至少有一半与荧光显微技术密切相关。

1 荧光显微技术的发明

荧光现象最早的描述被认为是16 世纪西班牙植物学家莫纳德斯（Monardes）对软质木质提取物荧光特性的报道。19 世纪早期研究发现，许多标本在紫外线照射下会发出荧光。1852 年，英国科学家斯托克斯（Stokes）在其出版的书中首创了“荧光”（fluorescence）一词。1882 年，德国科学家埃尔利希（Ehrlich，1908 年诺贝尔生理学或医学奖获得者）首先用荧光染料——荧光素钠确定眼睛中体液分泌的途径，开启了动物生理学使用荧光染料的先河。

早在19 世纪荧光方法就被应用，荧光显微技术的发明则在20 世纪后。德国物理学家科勒（Köhler）受阿贝（Abbe）发现波长越短分辨率越高的启发，于1904 年在德国耶拿的蔡司光学工厂制造了第1 台紫外（UV）显微镜。科勒注意到，在紫外线照射下某些物体会发出较长波长的光——荧光。依据这种现象，德国物理学家海姆施塔特（Heimstädt）于1911 年建造了第1 台荧光显微镜[2]。但是，因最初对成像物体自身荧光的依赖，以及对透射光和暗场聚光镜的需要限制了该显微镜的使用。

20 年后，奥地利的研究员海廷格（Haitinger）和其他科学家一起开发了二次荧光显微技术。与第1 次荧光显微技术不同的是，这次可将外源荧光化学物质应用于样品，并创造了“荧光色素”术语。1929 年，德国药理学家埃林格（Ellinger）和解剖学家赫特（Hirt）设计了第1 台以紫外线为光源，使之发出荧光的落射荧光显微镜，并对注射荧光素和色氨酸的啮齿类动物的肾脏和肝组织进行了观察。1942 年，库恩斯（Coons）用异硫氰酸荧光素标记抗体，标志着免疫荧光标记技术的诞生。1948 年，索尔兹曼（Saltzman）介绍了血液中水杨酸盐的荧光分析方法[3]，开启了荧光分析方法的先河。

2 荧光显微技术的发展

20 世纪30 年代虽已发明了比光学显微镜分辨能力更强大的电子显微镜，但其仍无法观察到活细胞的生理变化特征。光学显微镜虽可观察动态生命，但会受到光学方面的限制。为此，科学家为克服光学显微镜中的难题进行了不断的技术突破。主要体现在2 个方面：一是GFP（green fluorescent protein，简称GFP）的发现与应用，二是荧光显微镜的改进与应用。

2.1 GFP 的发现与应用

2.1.1 GFP 的发现 就生命科学而言，荧光显微技术本身的意义在于提高显微镜的分辨能力，多年来科学家也从未间断过寻找有效的荧光标本。GFP 的发现正是这方面具有里程碑意义的突破。1962 年的某一天，日本科学家下村修（Shimomura）在下班回家临出门前关灯后发现：实验室含有水母提取物——水母素的水池出现发光现象。由于水池也接受养鱼缸的水，他先怀疑是鱼缸成分影响了水母素，好奇心促使他继续研究，结果发现是钙离子增强了水母素发光。1963 年，下村修和约翰森（Johnson）在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后，里奇韦（Ridgway）和阿什利（Ashley）提出可用水母素检测钙浓度的方法。由于钙离子是生物体内的重要信号分子，该方法对研究生命科学至关重要。

2.1.2 FRAP 和FRET 技术 GFP 在应用上需要解决的一个突出问题是，荧光图像的衰减现象即光漂白影响了进一步观察。直至1976 年，阿克斯罗德（Axelrod）等才找到了解决方法——光脱色荧光恢复技术（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP），这种技术首先被应用到细胞膜蛋白质的研究之中，它使研究人员能以微米级分辨率阐明细胞膜内和细胞膜间蛋白质的运动。随着这些检测技术的改进，使得单分子动力学的量化成为可能[4]。同时，GFP 应用上又产生了一个重大进展，费尔南德斯（Fernandez）和柏林（Berlin）首次表明，20 世纪40 年代由福斯特（Förster）提出的荧光共振能量转移（fluorescence/forster resonance energy transfer，FRET）理论可用于研究细胞表面受体复合物的动态分布。因为与标准荧光标记相比，它促进了更高空间分辨率的受体分布测定，并利用荧光显微镜绘制高分辨率活细胞中的蛋白质分布和相互作用[5]。FRET 特别适合于细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的成像，因为要在FRET 信号中观察到变化，2 个荧光团必须非常接近。这些技术都为GFP 可视化探针的发现奠定了基础。

2.1.3 GFP 可视化探针 随着荧光显微技术上的改进，1993 年，巴克斯凯（Bacskai）和华裔美籍科学家钱永健等应用先进的激光共聚焦荧光显微镜和FRET 等技术，首先观察到了海兔（Aplysia）感官神经元在5-羟色胺刺激下环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基和调节亚基及游离cAMP 的变化。次年，钱永健又在实验室改良了多个GFP 变种，它们中有的荧光更强、更亮，有的呈黄色、蓝色，有的可激活、可变色，有的更稳定、更易激发。这使成像实验能跟踪细胞和生物体中的多个标记蛋白成为可能。同时，查尔菲（Chalfie）等在《科学》杂志发表的一篇报告中显示，维多利亚水母的GFP 可作为蛋白质定位和在活细菌及蠕虫细胞中表达的标记物，这样可将GFP 用于研究体内蛋白。GFP 作为体内蛋白质可视化探针的发现，为更复杂的显微技术奠定了基础。2008 年，下村修、查尔菲和钱永健因这方面杰出的工作分享了诺贝尔化学奖。

2.1.4 荧光双重标记实验 随着GFP 可视化探针的应用，宫崎骏（Miyawaki）等意识到GFP 及其他颜色的荧光蛋白虽具有高亮度和极好的光稳定性，但若能找到一些能变化和转化的荧光蛋白才会更清晰地分辨不同蛋白的作用。为此，他们在1997 年成功地构建了一个编码蓝色GFP 的CaM 和肌球蛋白轻链激酶（M13）的CaM 结合肽与绿色GFP 的构建体。这就如同不仅要给细胞内不同的蛋白分子穿上不同颜色的“服装”，而且还能观察其在活动中的相互结合及色彩或强度变化[6]。1999 年，马茨（Matz）等则进一步提出了类GFP 蛋白的荧光性质不一定都与发光生物有关的解释，并发现非生物发光的珊瑚礁同样呈现明亮的荧光颜色。这导致了荧光技术的首次双重标记实验，即将克隆的红色荧光蛋白或绿色变异体注射到非洲爪蟾胚胎的胚泡中，结果发现在蝌蚪期标记有单个蛋白质（红色或绿色）或2个蛋白质（黄色）的区域。2000 年，扎科洛（Zaccolo）等发现FRET 可测量蛋白质之间的相互作用。他们发现对cAMP 的生理刺激可导致FRET 的丢失，用这种生物传感器可检测cAMP 水平的生理变化。正是这些不断创新的方法，2003 年，美国科学家里德（Rieder）等观察到了活细胞的有丝分裂过程[7]。

2.2 荧光显微镜的改进与应用

2.2.1 激光共聚焦荧光显微成像 除了GFP 的发现和应用外，激光显微镜的改进及技术同样功不可没。首先是激光共聚焦显微镜的发明与应用。普通荧光显微镜使用中存在的问题之一是：放大至一定倍数后，会因失焦信息干扰导致分辨率衰减。在20 世纪60 年代，为消除这种现象，美国和捷克斯洛伐克的科学家应用1957 年由美国科学家即人工智能之父明斯基（Minsky）注册的专利技术原理，制造出共聚焦显微镜。但20 世纪80年代前，观察相对较厚标本存在技术上的困难，共聚焦显微镜的应用还十分有限[8]。1982 年，蔡司公司推出了能利用振荡激光束和电子图像处理进行物体扫描的激光共聚焦扫描显微镜，可从多个光学视角拆解较厚、较大检测样本。这如同盲人摸象一样，需要对多个扫面点综合。1987 年发表的2 篇论文开启了激光共聚焦显微镜在细胞生物学中的第1 个关键应用。其中一篇是德国海德堡欧洲分子生物学凯西门（Kai Simon）实验室用荧光神经酰胺标记跟踪新合成的鞘脂在上皮细胞中的转运，清晰地观察到该亚细胞过程[9]。到20 世纪80 年代末，激光共聚焦显微成像成为标准的荧光显微技术。1990 年，在激光扫描共聚焦显微镜的基础上，又诞生了可进行长期的活体细胞成像（例如，脑）和深部组织成像的双光子荧光显微镜。

2.2.2 反卷积算法 由于光通过某种介质时会发生弯曲，导致光学显微镜图像混浊和模糊。1983 年，科学家在使用琼脂和镇静剂时找到了一种解决办法——反卷积算法（deconvolution algorithms）。它利用显微镜光学特性的知识模拟成像过程，在几轮迭代计算中，将对象的估计值输入方程，并将计算结果与原始图像进行比较，以改进估计值，直至确定对象的真实属性。用这种方法首次获得了用荧光标记黑腹果蝇唾液腺细胞核内染色质结构和组织的高分辨率图像。1989年，费伊（Fay）及其同事用荧光标记平滑肌中蛋白质的研究中又取得了另一个关键进展，解决了反卷积算法可放大图像中的噪声使得很难缩小估计范围以确定真实物体的问题。这样产生的高分辨率图像，能定量分析平滑肌细胞中α-肌动蛋白的分布[10]。

2.2.3 超分辨率荧光显微镜 几乎就在人们热衷于研究GFP 技术的同时，另一项与GFP 相关的技术也出现了重大突破。这就是突破了光学上的衍射极限屏障即传统的光学显微镜（也称为远场光学显微镜）无法分辨150～200 nm 以下的物体。由于许多细胞过程发生在这个长度范围为数十到数百纳米的衍射极限距离内，传统的光学显微镜在达到最大理论分辨率后，无法进一步可视化。如何克服光学显微镜的衍射极限？

1990 年，正攻读博士学位的罗马尼亚出生的科学家黑尔（Hell）发现，若不是像常规那样使用1个透镜聚焦，而是将2 个大孔径的透镜组合在一起聚焦可突破这个极限，从而提高光学显微镜的分辨率。1993 年某天早晨，黑尔正在看一本有关光学量子理论的书，忽然灵感在他的脑海里浮现：用一束镭射激发荧光分子发光，用另一束镭射消除所有“大尺寸”物体的荧光。即通过运用2束镭射扫描样品，就可呈现出尺寸小于0.2 μm 的分辨图，突破权威认定的衍射极限屏障。经多次失败后，他制作了受激发射损耗显微镜（stimulated emission depletion，STED）。1994 年，黑尔在《光学快报》（Optics Letters）上发表了关于STED 的理论文章。但黑尔的工作曾经受到质疑，1999 年，他投给《自然》和《科学》杂志的研究成果均被退稿。直至2000 年，《美国国家科学院院刊》（PNAS）发表了黑尔的科研成果。黑尔被认为是首次得到了纳米级的荧光图像并将显微技术带入“纳米”领域的科学家。与此同时，1993 年，贝兹（Betzig）和奇切斯特（Chichester）首次报道了在室温下用近场扫描光学显微镜（NSOM）新技术对单个荧光团进行重复成像，并于1995年提出了单分子定位概念，开创了单分子成像的先河。1995 年，柳田（Yanagida）等使用优化的全内反射荧光显微镜实现了1个荧光团标记的ATP分子与肌球蛋白分子的相互作用，实现了单分子技术在生物系统中的首次应用，达到了能“亲眼目睹”活细胞内单个分子的动态化[11]。1997 年，莫尔纳（Moerner）在曾经开创了单分子检测及成像的基础上，又发现了光调控绿色荧光蛋白发光的方法，该方法成为光激活成像（PALM）等超分辨荧光成像方法的基础。这一重大发现，使贝兹等在2006年用荧光蛋白目睹了突破“阿贝分辨率”约10 倍（2～25 nm）的溶酶体和线粒体图像[12]。这些杰出的贡献，使黑尔、贝兹和莫尔纳共同分享了2014年的诺贝尔化学奖。

综上所述，在细胞生物学的发展中，荧光显微技术扮演了重要角色。正如著名的物理学家弗里曼（Freeman）所言：每次我们引进一种新的工具，总会带来意想不到的新发现,大自然的想象力比我们丰富。