优质籼稻剑叶SPAD值与稻米品质相关性研究

王志东 陈宜波 , 龚蓉 周少川 , 王重荣 李宏 黄道强 周德贵 赵雷 潘阳阳 杨义强 李晓芳

(1广东省农业科学院 水稻研究所，广州 510640；2广东省水稻育种新技术重点实验室，广州 510640; #共同第一作者; *通信联系人, E-mail:xxs123@163.com)

水稻是我国主要粮食作物，全国60%以上人口以稻米为主食。近年来随着经济快速发展和人们生活水平提高，大家对稻米食味品质要求越来越高。稻米品质主要包括外观品质、蒸煮食味品质、加工品质和营养卫生品质等。大部分消费者都是把稻米蒸煮成米饭后食用，米饭的口感、味道和色泽，即稻米蒸煮食味品质更受关注。目前，大量研究表明稻米直链淀粉和蛋白质含量是影响蒸煮食味品质的重要因素[1-8]。稻米蛋白质主要是由抽穗后叶片储存的蛋白质通过蛋白酶分解成氨基酸经韧皮部运送至籽粒，合成新的蛋白质[9]，籽粒蛋白质含量与叶片蛋白质含量密切相关[10-12]，叶片蛋白质含量与叶片SPAD(Single photon avalanche diodes，叶绿素相对含量)显著正相关，随着SPAD值的升高，叶片叶绿素含量和蛋白质含量都呈上升趋势[13-19]，SPAD值的变化动态地反映了叶片和籽粒的氮素营养状况。笔者推测水稻叶片SPAD值与稻米蛋白质含量和食味品质之间也存在着一定的相关性。目前，关于水稻叶片SPAD值与稻米蛋白质含量和食味品质相关性的研究鲜见报导。本研究选择直链淀粉含量中等，在华南地区具有代表性的优质籼稻美香占2号、黄华占和五山丝苗等12个品种(系)作为研究材料，在始穗期、齐穗期、乳熟期、蜡熟期和黄熟期测定剑叶SPAD值，适时收获，储藏2个月再测定稻米的各品质性状。依据剑叶 SPAD值-剑叶氮含量-稻米蛋白质含量-稻米食味品质这一技术路线，通过研究籼稻剑叶SPAD值与稻米品质性状之间的关系，探究剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量和食味品质之间的相关性，建立预测模型，达到选种或收获前利用叶片颜色变化预测籼稻食味品质和稻米蛋白质含量的目的，这对今后的优质籼稻食味育种和生产具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

为了降低直链淀粉含量差异对食味品质的影响，本研究选择 12个直链淀粉含量中等（16.5%～19.5%），均达到部标2级标准以上而且生育期较一致的稳定品种（系）作为试验材料，分别是美香占 2号、黄华占、五山丝苗、象牙香占、增城丝苗、五广占、五粤华占、五美占1号、五美占2号、五美占3号、五香丝苗1号和五香丝苗2号。其中，五美占1号、五美占2号和五美占3号是以美香占2号为母本，五广占为父本杂交并通过系统选育出来的稳定品系。五香丝苗1号和五香丝苗2号是以美香占2号为母本五山丝苗为父本杂交并通过系统选育出来的稳定品系。

1.2 方法

1.2.1 栽培管理

选取土壤肥力均匀，排灌设施良好的稻田作为试验用地，采用大田育秧，随机区组设计，3次重复。试验小区面积为2.33 m×1.17 m，株行距为16.65 cm×16.65 cm，每个小区种7行，每行14株，共98株。2018年7月21日播种，8月7日插秧，11月15日收获，栽培管理措施均相同。

1.2.2 叶片SPAD值的测定

用叶绿素分析仪(SPAD)通过测量叶片在两种波长范围内（650和940 nm）透光系数来测定SPAD值[20]。本研究采用SPAD-502型叶绿素含量测定仪于10月2日（始穗期）、10月11日（齐穗期）、10月19日（乳熟期）、10月30日（蜡熟期）和11月10日（黄熟期）8：00-10：00测定剑叶SPAD值。具体测定方法如下：在重复Ⅰ中每个材料选取生长均匀开花时期一致的水稻 10株，每株剑叶挂牌标记，然后在不同时期定点测量 10株，测量位置统一为剑叶中间，最后取平均值。

1.2.3 稻米食味值测定

将试验材料收获晒干贮藏2个月后，从重复Ⅰ中取样用小型碾米机把稻谷碾成精米，按米水质量比1∶1.2的比例将精米隔水蒸煮成米饭。采用日本佐竹公司生产的米饭食味计（SATA1B）测定米饭综合食味值、外观和口感，重复2次取平均值。

1.2.4 稻米品质性状测定

稻米收获晒干贮藏2个月后，从重复Ⅰ中取样，按农业农村部部颁标准米质测定方法(NY/T 83-2017)测定糙米率、精米率、垩白度、垩白粒率和透明度；按国家标准稻谷整精米率检验方法(GB/T 21719-2008)测定整精米率；按粮油检验国家标准稻谷粒型检验方法(GB/T 24535-2009)测定粒长和长宽比；按国家标准直链淀粉含量测定方法(GB/T 15683-2008)测定稻米直链淀粉含量；按食品安全国家标准食品中蛋白质测定方法(GB 5009.5-2016)测定稻米蛋白质含量；按粮油检验国家标准大米胶稠度测定方法(GB/T 22294-2008)测定胶稠度。

1.2.5 稻米淀粉黏滞性（RVA）谱特征值测定

淀粉黏滞性（RVA）谱反映的是米粉在加热-高温-冷却过程中在一定剪切力的作用下，淀粉-水体系的黏滞性变化所形成的糊化曲线，是淀粉热物理特性的反应[21]。本研究中稻米淀粉黏滞特征值按照美国谷物化学协会(AACC)的操作规程[22]进行测定，测定仪器采用澳大利亚Newport Scientific仪器公司生产的Super-4型快速黏度分析仪（RVA仪），用TCW3（Thermal Cycle for Windows）配套软件进行数据分析，测定数据包括峰值黏度(peak viscosity)、热浆黏度(hot past viscosity)和冷胶黏度(cool paste viscosity)。根据这3个基本黏度产生崩解值(Breakdown)、消减值(Setback)和回复值(Consistence)等 3个二级数据。计算公式如下：崩解值=峰值黏度-热浆黏度，消减值=冷胶黏度-热浆黏度，回复值=冷胶黏度-热浆黏度。6个特征值的单位是mPa·s。

1.3 数据分析方法

采用IBM SPSS Stastics 22统计软件和Excel 2007对数据进行统计分析。

图1 籽粒发育过程中12个籼稻品种（系）的剑叶SPAD值Fig. 1. SPAD values of flag leaves of 12 indica rice varieties (lines) during grain development.

2 结果与分析

2.1 籼稻籽粒发育过程中剑叶SPAD值的变化

为了揭示籼稻叶色在籽粒发育过程中的变化特征，我们选择华南地区具有代表性的优质籼稻美香占2号、黄华占和五山丝苗等12个品种（系）为研究材料，在始穗期、齐穗期、乳熟期、蜡熟期和黄熟期测定剑叶的SPAD值。由图1-A可见，随着水稻籽粒灌浆的完成，剑叶SPAD值呈逐渐降低的趋势，从始穗期至蜡熟期，SPAD值降幅差异较小；在黄熟期，SPAD值降至约始穗期的一半；此外，不同品种在不同发育时期的SPAD值也存在显著差异，其中五香丝苗1号和美香占2号在始穗期至乳熟期剑叶SPAD值低于绝大部分品种，而在蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值高于大部分品种，五山丝苗在始穗期剑叶SPAD值高于绝大部分品种，而在黄熟期剑叶SPAD值则最低（图1-A）。进一步分析不同品种在籽粒发育过程中剑叶SPAD值的变化情况，发现五山丝苗剑叶SPAD值变异系数显著高于其他品种，而五美占2号显著低于其他品种（图1-B），表明在籽粒发育过程中，五山丝苗的叶色变化幅度最大，五美占 2号的叶色变化幅度最小，持绿性最好。另外，我们将 12个品种（系）在各个生育时期的 SPAD值进行分析，发现籼稻剑叶SPAD值在始穗期、齐穗期和乳熟期这三个时期变异系数显著低于蜡熟期及黄熟期（图 1-C），表明12个品种（系）在前三个发育时期叶色差异较小，而随着籽粒灌浆逐渐完成，叶色差异逐渐显现，直至黄熟期达到最大。

2.2 籼稻剑叶SPAD值与稻米品质性状的相关性分析

水稻剑叶是籽粒发育过程中的重要碳源和碳源输出场所。前期研究发现，随着籽粒灌浆完成，剑叶颜色也随之发生显著变化。为了探究剑叶颜色深浅与稻米品质之间的关系，我们对12个品种（系）的剑叶 SPAD值与稻米品质性状进行相关性分析。研究结果表明，蜡熟期和黄熟期的剑叶SPAD值均与稻米蛋白质含量呈极显著负相关，相关系数分别为-0.77和-0.78，而其他品质性状，如碱消值、胶稠度、直链淀粉含量和脂肪含量均与剑叶SPAD值相关性不显著（表1）。我们进一步拟合了剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量的线性方程，蜡熟期的回归方程为y=-0.1116x+10.565，决定系数R2=0.5993（图2-A）；黄熟期的回归方程为y=-0.098x+9.217，决定系数R2=0.6028(图2-B)。以上结果表明通过蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值可以推测籼稻品种的稻米蛋白质含量。

图2 籼稻蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量的相关性分析Fig. 2. Correlation between SPAD value of flag leaf and protein content of indica rice in waxy ripening stage and yellow ripening stage.

表1 5个生育期剑叶SPAD值与稻米品质性状的相关系数Table 1. Correlation coefficients between SPAD value of flag leaf and rice quality characters in five growth stages.

2.3 籼稻剑叶SPAD值与稻米淀粉黏滞性谱（RVA）特征值的相关性分析

稻米 RVA谱是评价稻米蒸煮食味品质的重要指标，其特征值包括峰值黏度、热浆黏度、冷胶黏度、崩解值、回复值和消减值。我们对 12个籼稻品种（系）5个生育期的剑叶SPAD值与稻米RVA谱特征值进行相关性分析，发现蜡熟期剑叶SPAD值与峰值黏度呈极显著正相关，相关系数为 0.75，与崩解值呈显著正相关，相关系数为0.69；黄熟期剑叶SPAD值与峰值黏度和崩解值均呈极显著正相关，相关系数分别为0.84和0.85（表2）。我们将两个时期的剑叶SPAD值与峰值黏度和崩解值进行线性拟合，发现黄熟期与峰值黏度和崩解值的线性关系显著优于蜡熟期，黄熟期决定系数R2分别为0.709和 0.727，显著高于蜡熟期的决定系数 0.565和0.471（图3）。已有研究表明，RVA谱特征值中的峰值黏度和崩解值与稻米食味品质呈显著正相关，食味好的品种普遍表现为峰值黏度及崩解值较高，而食味较差的品种则相反[23-24]。因此，我们对12个籼稻品种（系）的稻米食味值与RVA特征值进行相关分析，发现峰值黏度和崩解值均与稻米食味值呈极显著正相关，相关系数分别为 0.76和0.85（表2）。表明随着峰值黏度和崩解值的上升，稻米食味值逐渐升高，与前人研究结果一致。通过对稻米食味值与RVA特征值相关性分析，以及籼稻剑叶SPAD值与RVA特征值的相关性分析，我们发现籼稻剑叶SPAD值与稻米食味密切相关。

图3 籼稻蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米淀粉峰值黏度和崩解值的相关性分析Fig. 3. Correlation analysis between SPAD value of flag leaf and peak viscosity value and breakdown of rice starch in waxy ripening stage and yellow ripening stage of indica rice.

表2 5个生育时期剑叶SPAD值和稻米食味值与稻米淀粉黏滞性（RVA）谱特征值相关系数Table 2. Correlation coefficient between SPAD value of flag leaf, rice taste value and RVA spectrum characteristic value of rice starch in five growth periods.

图4 籼稻蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值的相关性分析Fig. 4. Correlation analysis between SPAD value of flag leaf and rice taste value in waxy ripening stage and yellow ripening stage of indica rice.

表3 稻米食味品质与剑叶SPAD值和蛋白质含量的相关系数Table 3. Correlation coefficients between rice taste quality and SPAD value and protein content of flag leaf.

2.4 籼稻剑叶SPAD值与稻米食味品质的相关性

为了探究籼稻剑叶SPAD值与稻米食味品质之间的关系，我们对12个品种（系）5个生育时期的剑叶SPAD值与稻米食味值、口感及外观进行相关性分析，结果发现蜡熟期和黄熟期的剑叶SPAD值与稻米食味值、口感和外观均呈极显著正相关，蜡熟期SPAD值与食味值、口感和外观相关系数分别为0.77、0.73和0.77，黄熟期SPAD值与这三者的相关系数分别为0.83、0.82和0.81（表3），黄熟期与三者的相关系数均大于蜡熟期。我们进一步将这两个时期的SPAD值与稻米食味值进行线性拟合，发现蜡熟期SPAD值拟合的线性关系中的决定系数R2值为0.587，黄熟期的决定系数R2值为0.687（图4），黄熟期与食味值的相关系数大于蜡熟期。

已有研究表明稻米蛋白质含量与食味品质呈显著负相关，蛋白质含量越高，米饭食味口感一般越差[1-8]。我们对12个品种（系）的蛋白质含量与稻米食味值进行相关性分析，发现稻米蛋白质含量与食味品质呈极显著负相关，相关系数达-0.73（表3），表明随着蛋白质含量的升高，米饭食味值和口感逐渐下降，与前人的研究一致。前面通过分析剑叶SPAD值与蛋白质含量的相关性，发现蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量呈显著负相关（表 1），而稻米蛋白质含量又与稻米食味值呈极显著负相关（表 3），这在另一角度进一步说明成熟后期剑叶SPAD值与稻米食味呈极显著正相关，成熟后期叶片不早衰，熟色好，则食味好。以本团队培育的广东省主推品种美香占2号和和五山丝苗为列，美香占2号在蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值比五山丝苗高（图1-A），田间表现持绿性好、转色顺、熟色好，而五山丝苗后期叶片衰黄得快。在生产实践中美香占2号是特优质经济效益高的品种，曾连续两届获得全国优质稻品种食味品质鉴评会金奖，食味品质明显优于五山丝苗。同样说明了黄熟期青枝蜡秆，不早衰，熟色好，叶片含氮量较高，转运至籽粒中的蛋白质较少，则稻米食味好。

3 讨论

3.1 籼稻籽粒发育过程中不同生育时期剑叶SPAD值与稻米品质性状关系

目前研究籼稻叶片SPAD值与稻米品质关系的研究鲜见报导，前人在玉米和小麦等作物中做了相关性研究。张丽等[25]在玉米中发现叶片SPAD递减值与成熟期籽粒蛋白质含量呈显著负相关，叶片SPAD递减值可作为判定成熟期籽粒蛋白质含量高低的指标。高飞等[26]研究发现小麦旗叶SPAD值的递减速率与籽粒蛋白质含量呈显著负相关，可以利用旗叶SPAD值递减速率对籽粒蛋白质含量进行预测；王增裕等[27]发现小麦叶片含氮量在开花后19～25日这一段时间内的下降幅度与籽粒含氮量百分比呈显著正相关。可见在高等植物中叶片SPAD值与籽粒含氮量密切相关。本研究结果表明，籼稻蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量呈极显著负相关，黄熟期的相关系数比蜡熟期更大，始穗期、齐穗期和乳熟期剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量相关性不显著。目前，大部分学者认为稻米食味与蛋白质含量呈显著负相关[1-8]。本研究结果也表明稻米食味值与蛋白质含量呈极显著负相关。所以通过分析剑叶SPAD值与稻米蛋白质含量相关性和蛋白质含量与食味品质的相关性，说明籼稻成熟后期剑叶SPAD值与稻米食味品质呈显著正相关。

关于剑叶SPAD值与稻米淀粉谱特征值的关系，目前也鲜有研究报导。本研究通过分析 12个籼稻品种（系）5个生育时期剑叶SPAD值与稻米淀粉谱特征值的相关性，发现黄熟期剑叶SPAD值与峰值黏度和崩解值均呈极显著正相关，蜡熟期剑叶SPAD值与峰值黏度和崩解值呈极显著和显著正相关。黄熟期与峰值黏度和崩解值相关性均比蜡熟期强。始穗期、齐穗期和乳熟期剑叶SPAD值与稻米RVA谱特征值相关不显著。前人研究认为RVA 谱特征值中的峰值黏度、崩解值和回复值与稻米蒸煮食味品质呈显著正相关，主要影响米饭柔软性和黏度等，能更贴切地反映米饭口感和质地[23-24]，可作为评价稻米食味品质优劣的重要指标。本研究结果也表明稻米食味值与峰值黏度和崩解值呈极显著正相关，与前人研究结果一致。通过分析剑叶SPAD值与淀粉RVA谱特征值的相关性，和淀粉RVA谱特征值与食味品质的相关性，也说明籼稻成熟后期剑叶SPAD值与稻米食味品质呈显著正相关。

本研究通过直接分析5个生育时期剑叶SPAD值与稻米食味品质关系，发现当稻米直链淀粉含量中等且相近时，籼稻蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值和米饭口感均呈极显著正相关，同样是黄熟期相关系数比蜡熟期大。以上结果均表明籼稻成熟后期剑叶SPAD值与稻米食味品质呈显著正相关。黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值的相关性比蜡熟期更高。而始穗期、齐穗期和乳熟期剑叶SPAD值与稻米品质性状、淀粉RVA谱特征值和食味品质性状相关性不显著。即成熟期剑叶SPAD值越高，叶片持绿性越好，叶片蛋白质含量越高，可能叶片转移到籽粒中的蛋白质就越少，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越高，稻米食味值就越高。相反，成熟期剑叶SPAD值越低，叶片越黄，籽粒蛋白质含量越高，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越低，稻米食味值越低。

3.2 黄熟期剑叶SPAD值影响稻米食味品质原因探讨

本研究结果表明，籼稻黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味品质呈极显著正相关，成熟时青枝蜡秆，转色顺、熟色好、食味好，相反叶片衰老发黄，食味差。笔者推测可能是水稻营养生长期随着叶片颜色加深，叶片中积累的氮素逐渐增加，在灌浆成熟期随着叶片慢慢衰老，叶片中的氮素逐渐转移至籽粒中合成蛋白质，后期叶片SPAD值越低，叶片的氮素含量越少，说明叶片向籽粒转运的氮素越多，使得籽粒当中的蛋白质含量越高。稻米蛋白质含量高，蛋白质可能通过二硫键结合形成蛋白质网络，减少了淀粉水合的有效含水量，协同提高了糊化多相体系的浓度，增强了分散相与黏稠相的相互作用，最后抑制了淀粉的糊化。同时，高蛋白质使得籽粒结构紧密，大量蛋白体填塞在淀粉体间的空隙，导致米粒淀粉糊化时不能充分吸收水分，淀粉不能充分膨胀[28-30]。另一方面蛋白质含量越高，其与淀粉结合越紧密，打破蛋白质网络使淀粉糊化就需要更多的能量，同样导致稻米淀粉糊化膨胀受到抑制。当淀粉粒的糊化和膨胀被抑制时，稻米淀粉峰值黏度和崩解值均降低，米饭就表现为黏性小，硬度大，口感食味差，这也解释了为什么稻米蛋白质含量越高，稻米淀粉峰值黏度、崩解值越低，米饭食味越差。所以蛋白质不仅是稻米营养品质的重要组成部分，其含量的高低也直接影响稻米的蒸煮食味品质。

当籼稻直链淀粉含量中等且相近时，蜡熟期和黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值呈极显著正相关，与蛋白质含量呈极显著负相关，黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值和蛋白质含量的相关性比蜡熟期高。利用黄熟期剑叶SPAD值可以预测籼稻食味值，回归方程为y=0.901x+65.76，决定系数R2=0.687；利用黄熟期剑叶SPAD值可以预测籼稻稻米蛋白质含量，回归方程为y=-0.098x+9.22，决定系数R2=0.602。本研究通过分析籽粒发育过程中5个生育时期剑叶SPAD值与稻米品质性状的相关性，建立了黄熟期剑叶SPAD值与稻米食味值和蛋白质含量之间的相关关系和预测模型。达到在选种或收获前通过剑叶SPAD值预测水稻食味品质和稻米蛋白质含量的目的，为今后的优质籼稻食味育种、高氮白水稻育种和利用叶色监测水稻品质技术奠定理论基础，这在今后的优质籼稻食味育种和生产中具有非常重要的意义。但这只是表型性状的关系，叶片叶绿素含量变化是如何影响叶片和籽粒蛋白质含量积累，进而影响米饭食味的形成机理还需要进一步深入研究。