一株牛源黄腐短杆菌的分离鉴定

刘 嘎， 蒙小刚，2， 史量全，2， 东彦新， 潮洛蒙， 刘 锴，2， 徐 静

(1.内蒙古民族大学动物科技学院；2.内蒙古自治区肉牛疾病防控工程技术研究中心，内蒙古 通辽028000)

牛腐蹄病也叫趾(指)间坏死杆菌病、趾(指)间蜂窝织炎，是指牛蹄部趾间皮肤以及深部组织发生的急性或亚急性炎症[1].引起牛腐蹄病的原因很多.饲养管理方面， 主要是草料中钙、磷不平衡， 导致牛角质疏松，蹄变形和不正；牛舍不干净、潮湿， 运动场泥泞， 蹄部经常浸泡于粪尿、泥浆，致使局部组织软化；石子、铁屑及坚硬的草木、玻璃碴等刺伤软组织而引起蹄部发炎[2].病原微生物方面，坏死梭杆菌、节瘤拟杆菌、结节状类杆菌、酵母菌、产黑色素类杆菌和某些球菌等都能引起腐蹄病.其中，坏死梭杆菌是一种人畜共患病病原，可以引起人和牛、羊、猪等多种动物局部组织的化脓、坏死性疾病，在腐蹄病中较为常见[3-4].内蒙古通辽市某牛场中饲养的一头牛发生腐蹄病，主要表现为蹄部严重腐烂、骨外露，腐烂部位最初呈现脓疱状，之后脓疱破裂形成脓洞，最后每个脓洞连在一起导致整个蹄部腐烂.本研究从该牛场的发病犊牛蹄部分离并鉴定出一株黄腐短杆菌(Brevibacterium luteolum)，是牛腐蹄病致病菌的新发现，可为生产中该病的预防及科研人员的研究提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料及试验动物 通辽市某养牛场送检的一只犊牛，牛左前肢蹄部腐烂.BALB/c 小白鼠(20 g 左右)10 只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司.

1.1.2 主要试剂及仪器 2×Taq master Mix、DNA 提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，均购自天根生化科技(北京)有限公司；抗菌药物药敏纸片，购自杭州市滨和有限公司；dNTPs，购自宝日医生物技术(北京)有限公司；C600 凝胶成像系统，购自北京深蓝云生物科技有限公司；PCR 仪，购自美国Thermo 公司；DL2 000 DNA Marker，购自上海生工股份有限公司；BD phoenixTMNMIC/ID-4 鉴定卡、BD phoenixTM100 全自动微生物鉴定仪、革兰氏阴性菌鉴定板及鉴定肉汤，均购自于美国BD 医疗器械有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离和培养 用接种环无菌采集牛犊左前肢蹄部腐烂组织，分别划线接种于普通琼脂培养基和血平板上，在37 ℃恒温箱厌氧培养24 ～36 h，分离菌落经革兰氏染色，观察染色情况[5].挑取单菌落放入LB 液体培养基中，在37 ℃恒温摇床(150 r·min-1)下扩增培养12 h，后在4 ℃冰箱保存备用.

1.2.2 致病性试验 将小白鼠分成试验组和对照组，每组5 只，试验组每只小白鼠腹腔注射2.0×1010CFU·mL-1分离菌0.5 mL，对照组每只小白鼠注射0.5 mL 生理盐水.每隔4 h 观察一次小白鼠.

1.2.3 生化试验 用无菌棉签蘸取纯培养的单个菌落并接种于ID 肉汤鉴定培养管中，调成1.8×109CFU·mL-1的菌悬液，将液体倒入革兰氏阴性菌鉴定板上对应的生化鉴定孔，放入BD phoenixTM100 全自动微生物鉴定仪中，录入信息，反应结束后记录结果.试验重复3 次[6].

1.2.4 药敏试验 吸取200 μL 菌液均匀涂布在普通培养基表面，室温放置4～7 min 后，选取庆大霉素、卡那霉素、青霉素、多西环素等12 种抗生素药敏片，贴在平板表面，37 ℃恒温孵育24 h，测量抑菌圈直径.根据药敏片判别标准判断该菌的药物敏感性:抑菌圈直径≥6 mm 为敏感，抑菌圈直径＜6 mm 为耐药.

1.2.5 16S rRNA 基因PCR 扩增 根据细菌核酸提取试剂盒说明书提取分离菌的核酸，以此为模板，采用16S rRNA 通用引物进行PCR 扩增，上游引物为27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物为1492R 3′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-5′，上、下游引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.PCR 扩增反应体系(25 μL):PCR Mastermix 12.5 μL，模板3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7.5 μL.扩增程序:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环数；72 ℃延伸10 min.PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察并记录结果.

1.2.6 菌株遗传进化树及遗传距离分析 将PCR 扩增产物送至北京生工生物股份有限公司测序，将测得的序列在NCBI 上进行BLAST 比对分析，选取同源性较高的序列，用MEGA 6.0 软件构建遗传进化树和遗传距离表.

2 结果与分析

2.1 分离菌培养特征

分离菌厌氧培养24 h 后，才开始有菌落生长，说明分离菌生长缓慢；菌落在普通培养基和血平板上均呈现黄色、圆形，表面光滑且湿润，边缘整齐(图1).经染色后镜检可知，分离菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢荚膜(图2).纯化后的菌株被命名为LG-01.

图1 菌株LG-01 在普通琼脂培养基(A)和血平板(B)上的生长情况Fig.1 Growth of strain LG-01 on common agar medium (A) and fresh blood medium (B)

2.2 分离菌的致病性

小白鼠腹腔注射分离菌液8 h 后开始产生病变，爪部出现红肿，血管膨胀(图3A)；12 h 左右开始出现脓包(图3B)；16 h左右腿部腐烂(图3C～D)，小鼠死亡.将死亡小鼠解剖，对肝脏及脾脏进行涂片、染色，在显微镜下观察的菌落形态和染色结果与所接种菌一致，说明该菌为牛腐蹄病的致病菌.

2.3 分离菌的生化特性和药物敏感性

菌株LG-01 对L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素为阳性反应，其余为阴性反应(表1).BD phoenixTM100 鉴定结果显示，该分离菌为黄腐短杆菌.

图2 菌株LG-01 革兰氏染色结果(1 000×)Fig.2 Gram staining result of strain LG-01(1 000×)

图3 菌株LG-01 引起小鼠的病变特征Fig.3 Pathological characteristics of mice infected with strain LG-01

表1 菌株LG-01 生化特性1)Table 1 Biochemical characteristics of strain LG-01

药敏试验结果(表2)显示，分离菌对卡那霉素、丁胺卡那、红霉素产生了耐药性，但对其余9 种抗生素敏感.

表2 菌株LG-01 对12 种抗生素的敏感性1)Table 2 Sensitivity of strain LG-01 to 12 antibiotics

2.4 16S rRNA 基因PCR 扩增结果

16S rRNA 基因PCR 扩增结果显示，在1 000～2 000 bp间有一条清晰的条带，经测序，确定其长度为1 434 bp(图4).

2.5 16S rRNA 基因遗传进化树分析及遗传距离比较

将所得序列经BLAST 比对发现，菌株LG-01 与B.luteolum的同源性达到99%；遗传进化树(图5)显示，菌株LG-01 与登录号为AB210988.1 的B.luteolum聚在同一分支上，亲缘关系最近，两者的遗传距离为0.003，小于LG-01 与其他菌株的遗传距离(表3).因此，最终确定所分离的菌株为黄腐短杆菌(B.luteolum).

图4 16S rRNA 基因PCR 扩增结果Fig.4 PCR amplification of 16S rRNA genes

图5 基于16S rRNA 基因构建的菌株LG-01 与其同源性较高菌株的遗传进化树Fig.5 Genetic evolution tree of strain LG-01 and strains with high homology based on 16S rRNA gene

3 讨论

注射分离菌液后大多数小鼠的发病过程表现为:初期蹄部红肿；中期蹄部出现脓疱，之后脓疱增多并破裂，整个蹄部腐烂坏死，有黄色浓汁流出并结痂，散发恶臭味；后期大腿部肌肉僵硬坏死，致使其行动不便，最后死亡.发病症状与送检犊牛的情况相符，由此可以判断该分离菌是引发此次犊牛腐蹄病的主要致病菌.通过菌落形态观察、生化特性测定和16S rRNA 基因分析，将该菌确定为黄腐短杆菌.

表3 菌株LG-01 与其同源性较高菌株的遗传距离Talbe 3 Genetic distances between strain LG-01 and others sharing high homology

牛腐蹄病是一种发病率高、接触传染性强的危害养牛业的三大疾病之一[7].为有效控制该病在牛群中传播，需要对致病原因进行准确把握[8].节瘤拟杆菌和坏死梭杆菌是导致牛腐蹄病的主要病原微生物，节瘤拟杆菌通过Ⅳ型纤毛和细胞外蛋白酶产生致病作用，而坏死梭杆菌由病原体产生白细胞毒素、内毒素脂多糖及溶血素而产生致病作用，混合感染情况下， 仅少量的坏死梭杆菌即可诱发腐蹄病发生[9].本次从犊牛病变部位分离的黄腐短杆菌，是一种革兰氏阴性短杆菌，其对家畜的感染情况尚未见报道，有关该菌的致病性有待进一步研究.Jorge[10]和Thankaswamy et al[11]研究表明，黄腐短杆菌可用于微生物降解和生物催化剂等方面，所以对该菌的用途还有待探索.

此外，营养、环境等都是造成牛腐蹄病发生的重要因素[12].养殖人员应对畜舍进行定期消毒灭菌，及时修剪牛蹄部，适当对牛蹄进行药浴，以预防该病的发生.