桃仁红花煎通过抑制淋巴管增生改善ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的炎症反应

王怡茹， 张一凡， 韦婧， 刘萍*

(1.上海中医药大学 附属龙华医院 心病科， 上海 200032； 2.上海徐汇区中心医院 中医科， 上海 200031)

流行病学调查显示心血管疾病在20岁以上人群中的患病率为48%，是全球主要死亡原因之一[1-2].动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是诱发大多数心脑血管疾病的重要病理基础[3]，与AS相关的心脑血管疾病发病率持续上升且呈年轻化趋势[4].因此，积极探索AS病理机制和有效治疗方案具有重要临床意义.AS与自身免疫的关系由Ross[5]首次提出：动脉粥样硬化病变是由于血管内皮和平滑肌细胞等各种因素损伤而产生的过度化炎症性-纤维增殖性反应.炎症反应是AS重要的病理机制之一，不同的分子和细胞实验证实炎症反应贯穿AS病理进程的始末[6-7]，为其发病机制提供全新阐释[8].但是在AS的相关指南和实际临床治疗方案中主要以降低血脂和稳定斑块为主，并未对粥样硬化斑块引起的急慢性炎症给予针对性的治疗[9].

文献报道活血化瘀药物可抑制过度的炎症因子表达，如白介素(interleukin, IL)家族中的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)等[10-12].桃仁红花煎出自宋代名医陈素庵的《素庵医案》，很多文献书籍将其列为AS之心血瘀阻证型的代表方剂.桃仁红花煎君以桃仁、红花、延胡索、丹参、香附行气通络、活血化瘀，臣以青皮、川芎、赤芍活血通络，当归、生地养血祛瘀为其佐，并用乳香为其使，芳香行气.全方共奏活血化瘀、理气通络之功.近年来对桃仁红花煎用于心血管疾病的研究日益增多.桃仁红花煎的药理学分析发现该方可通过抗炎、扩张血管和抑制细胞增殖等在心血管疾病中发挥治疗作用[13].基础研究发现桃仁红花煎可以显著抑制寒凝血瘀型大鼠血清中血小板聚集[14].临床研究结果提示，桃仁红花煎可以改善劳力性心绞痛心血瘀阻症患者的心绞痛积分、运动代谢当量及抑制炎症反应[15]，提高冠心病、缺血性心脏病患者的临床治疗的有效率[16]，减少房颤患者发作次数、发作时间等[17].

本研究拟探索桃仁红花煎是否可减少粥样硬化斑块面积以及对其潜在作用机制进行探讨.

1 材料与方法

1.1 实验动物与动脉粥样硬化模型

6～8周龄的SPF(specific pathogen free)级别雄性ApoE-/-小鼠，体质量在19～26 g范围内，实验开始前给予1周普通饲料适应性喂养，1周后采用高脂饲料进行为期8周的造模，高脂饲料成分为：78.85%普通饲料+21%猪油+0.15%胆固醇(由常州鼠一鼠二生物科技有限公司合成及质控).另有6～8周龄的SPF级C57BL/6小鼠作为空白组对照，给予普通饲料喂养.本研究动物实验得到上海中医药大学附属龙华医院动物管理委员会批准实施(批准号：No. 2019-N002).

1.2 实验干预药物

本研究采用的干预药物为辛伐他汀(商品名为舒降之，美国默沙东公司生产，货号：6951283550390).中草药来源于上海中医药大学附属龙华医院中药房，并由中药房资深药师进行质量评估，产地及货号见表1.已有研究对本方组分进行鉴定[13]，结果提示中药复方桃仁红花煎中共含有672种化合物分子(表1).另外，对本研究采用的桃仁红花煎进行高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)鉴定，结果提示有8种化合物的占比较高：苦杏仁苷(0.904 1%)、芍药苷(0.601 3%)、丹参酚酸B(0.481 2%)、羟基红花黄色素A(0.378 9%)、橘皮苷(0.253 3%)、延胡索乙素(0.130 2%)、阿魏酸(0.025 3%)和丹参酮(0.003 5%).

表1 桃仁红花煎化学成分鉴定Table 1 Identification of chemical composition of TaorenHonghua formula

1.3 试剂和仪器

Anti-CD3 antibody(ab5690)为美国abcam公司产品；Anti-LYVE-1 antibody(ab14917)为美国abcam公司产品；goat anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®(488, # 4412)为美国CST公司产品；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)为美国abcam公司(ab104139)产品；RNA提取试剂盒为中国EZBioscience公司产品；反转录试剂盒为日本TAKARA公司产品；酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒为中国威奥公司产品；实时荧光定量基因扩增仪7500(0100147484)为美国应用生物系统公司产品；冰冻切片机(CM1950)为德国徕卡公司产品；倒置式显微镜(403497)为日本Nikon公司产品；倒置荧光显微镜(Ti-E)为日本尼康公司产品.引物为上海生工公司产品，引物序列见表3.

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

将ApoE-/-小鼠按照随机数字表法分为5组，前4组每组12只，分别模型组(MOD)、桃仁红花煎高剂量组(FH)、中剂量组(FM)和低剂量组(FL)，空白组(CON)C57BL/6小鼠10只.根据课题组前期研究的基础及查阅的文献，ApoE-/-小鼠给予高脂饮食饲养8周时检测是否成模并根据结果给予干预，高、中、低剂量组的桃仁红花煎质量浓度依次为3.630 0、1.815 0、0.907 5 g/mL，每天灌胃2次，每次给予0.3 mL，给药周期为12周.空白组给予生理盐水，灌胃方法及时间同给药组.

1.4.2 体质量监测及生化检查

从造模开始到完成干预期间每周称量小鼠体质量1次，动态监测其变化.眼球取血后3 000 r/min离心15 min，取血清并稀释2.5倍后，检测小鼠甘油三酯(TRIG)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(CREA)、尿素(UA)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST).检测由上海中医药大学附属龙华医院检验科MODULAR全自动生化鉴定仪完成.

1.4.3 组织病理学检测

将小鼠心脏及纵膈淋巴结(位于主动脉弓前方和前腔静脉的侧面，一般包含1～2个淋巴结[18])取出后放于体积分数为4%的多聚甲醛，4 ℃固定24 h后，依次于质量分数为10%、20%和30%蔗糖溶液各脱水24 h，采用冰冻切片包埋剂进行包埋，心脏做横切面切片并显露心房及主动脉窦，心脏和淋巴结切片厚度均为10 μm.将心脏心房和淋巴结免疫荧光染色，主动脉窦行油红O染色.分别于共聚焦显微镜和光学显微镜下观察拍照.

1.4.4 血清炎症因子检测

按方法1.4.2提取血清并稀释2.5倍后，参照ELISA试剂盒说明书分步检测血清炎症因子(IL-6、IL-10和TNF-α)的水平，采用酶标仪在D(562 nm)下检测.

On the inconsistency of the surface air temperature forecasts over East Asia using TIGGE data

1.4.5 主动脉炎症相关基因mRNA水平检测

采用试剂盒提取主动脉总RNA并反转录后，实时荧光定量PCR法检测炎症相关基因IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA表达水平.

1.5 统计学分析

运用SPSS 22.0软件分析结果，数据采用(平均数±标准差)表示，两组数据符合正态分布则采用两独立t检验，多组数据符合正态分布则采用方差分析，否则采用非参数检验.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 桃仁红花煎可降低小鼠体质量和血脂

如图1A-1C所示，通过8周高脂饮食造模后，小鼠的体质量、TRIG、CHOL、HDL和LDL明显升高(P<0.05,P<0.01)，桃仁红花煎可有效减轻小鼠体质量、TRIG和CHOL浓度，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).另外，桃仁红花煎可降低LDL和升高HDL浓度，但无统计学差异.同时给药组肝肾功能指标与空白组及对照组比较，均无统计学差异.

A：造模第8周和第20周(干预第12周)的小鼠体质量.1)MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较，P<0.05； B：小鼠从适应性喂养到干预完成期间体质量变化情况(0～1代表适应性喂养1周，1～9代表造模1～8周，9～21代表药物干预12周)； C：药物干预结束后各组小鼠TRIG、CHOL、HDL和LDL浓度, 1)MOD组与CON组比较P<0.01， 2)给药组与MOD组比较P<0.05； D：药物干预结束后各组小鼠ALT、AST和CREA水平.

2.2 桃仁红花煎可减小主动脉窦斑块面积

如图2所示，在倒置显微镜下观察(×100)，细胞核呈蓝色，间质无色，粥样硬化的脂肪区域呈现橘黄色.空白对照组未观察到斑块，模型组含有广泛而典型的动脉粥样硬化成熟斑块，FH、FM和FL组可观察到桃仁红花煎干预后脂肪斑块明显缩小，且桃仁红花煎的质量浓度越高，脂肪斑块含量越少.

图2 小鼠主动脉窦斑块油红O染色镜下改变(×100)

2.3 桃仁红花煎抑制心房肌淋巴管增生

如图3所示，在倒置荧光显微镜下观察(×200)，细胞核呈蓝色，淋巴管呈绿色(淋巴管表面的LYVE-1特异性抗体).空白对照组小鼠的心房肌淋巴管含量相对较少，且形态规则，呈完整的管腔状；而模型组小鼠的心房肌淋巴管数量较空白组数量明显增加，形态杂乱、粗大，大部分的淋巴管呈非闭合式管腔结构；通过不同浓度桃仁红花煎干预的小鼠，心房肌淋巴管数量减少，管腔形态规则、完整.

图3 小鼠心房淋巴管的免疫荧光染色镜下改变(×200)

2.4 桃仁红花煎减少淋巴结中T细胞含量

如图4所示，在倒置荧光显微镜下观察(×100)，细胞核呈蓝色，绿色区域为T淋巴细胞(T淋巴细胞表面的CD3特异性抗体)，绿色荧光越强则代表T细胞数量越多.模型组小鼠的纵膈淋巴结中T细胞含量较空白组明显增加，通过高剂量桃仁红花煎干预组的小鼠，其纵膈淋巴结中T细胞含量较模型组明显减少.

图4 小鼠纵膈淋巴结中T细胞含量的免疫荧光染色

2.5 桃仁红花煎可降低主动脉炎症相关因子的mRNA表达

提取小鼠主动脉的总RNA，通过实时荧光定量PCR方法对其进行检测.如图5所示，模型组与空白组比较，IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量升高，IL-10的mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05).桃仁红花煎干预后，IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量明显降低(P<0.01)，而IL-10的mRNA相对表达量仅有中剂量组可见明显增加，差异有统计学意义(P<0.01).

A：IL-6的mRNA相对表达量， 1)MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较，P<0.01； B：IL-10的mRNA相对表达量， 1)MOD组与CON组比较，P<0.05，2)给药组与MOD组比较，P<0.01； C：TNF-α 的mRNA相对表达量， 1)MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较，P<0.01.

2.6 桃仁红花煎降低血清炎症因子的表达

处死各组小鼠前，通过眼球取血并离心获得血清，采用ELISA法检测各组小鼠血清中炎症因子的表达情况.如图6所示，模型组小鼠的血清IL-6和TNF-α质量浓度较空白组明显升高(P<0.01)，IL-10质量浓度稍有升高但不具有统计学差异.通过桃仁红花煎干预后，IL-6和TNF-α表达水平较模型组明显降低(P<0.01)，IL-10表达水平仅在低剂量组较模型组有所提高(P<0.05).

A：小鼠血清IL-6质量浓度. 1)MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较, P<0.01； B：小鼠血清IL-10质量浓度.1) MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较,P<0.05； C：小鼠血清TNF-α质量浓度.1) MOD组与CON组比较，给药组与MOD组比较P<0.01.

3 讨论

本研究为采用中药复方干预并探索其对AS过程中心脏淋巴管和心脏淋巴结T细胞数量变化的实验研究，具有一定的创新性.对于动脉粥样硬化与炎症反应相关性的认识，使得人类对AS的发生发展以及治疗策略有了全新的理解和机会.近年来，淋巴管在心血管疾病中的作用逐渐成为人们关注焦点，以期为患者寻找到一个全新有效的治疗途径[19].哺乳动物的循环系统包括血管和淋巴管[20]，虽然淋巴管内皮细胞仅占成年人心脏细胞的3%[21]，不过研究表明心肌淋巴管增生和免疫细胞运输增强在AS中起重要作用[22]，AS进展期斑块病变处亦出现淋巴管数目增多的现象[23].本研究结果提示：模型组小鼠的心脏淋巴管较空白组数量增多，且形态杂乱，管腔结构严重受损，可能增强AS过程中的炎症反应；桃仁红花煎干预后3组小鼠的心脏淋巴管数量明显减少，且形态规则，管腔结构完整，可能在一定程度上抑制了慢性炎症反应.另外，既往心脏淋巴管染色多采用免疫组织化学法，本研究采用冰冻切片结合免疫荧光染色技术，发现此法可更加清晰展示淋巴管的形态和数量，但是需要注意冰冻切片的质量，一旦卷片则无法呈现淋巴管完整的结构.

心脏淋巴结在心血管疾病发生发展中的作用也得到更多的医学工作者关注，报道称急性心血管事件中患者的T细胞数量明显高于病情稳定的患者，即T细胞含量的增多会提高突发心血管事件的风险[24]；另有研究表明在稳定型心绞痛和急性冠状动脉综合征患者的胸淋巴结中调节性T细胞数量明显增加，且淋巴结和血液之间的淋巴细胞亚群存在一定差异[25]，所以无法简单通过外周血淋巴细胞含量判断AS患者炎症情况.本研究通过特异性CD3抗体标记纵膈淋巴结T淋巴细胞，评估AS中炎症反应的情况.如前所述，模型组的纵膈淋巴结中T细胞数量较空白组明显增多，这说明模型组小鼠的体内炎症反应更强；而桃仁红花煎高剂量组小鼠的纵膈淋巴结中T细胞数量较模型组减少，从而推断桃仁红花煎可能通过减少T细胞数量以发挥抑制AS炎症反应的作用.

此外，本研究亦发现桃仁红花煎可以减轻小鼠体质量，降低小鼠血清甘油三酯和总胆固醇含量，缩小主动脉窦油脂型斑块面积，对IL-6和TNF-α具有明显的抑制作用，但是对IL-10的升高效果不明显，推测桃仁红花煎发挥抗炎作用主要是通过抑制促炎因子，而非提高抑炎因子的表达.

本研究初步证明桃仁红花煎具有一定的抗动脉粥样硬化作用，并推测其发挥效应可能与抑制心脏淋巴管增生、减少纵膈淋巴结T细胞含量以及减轻相关炎症因子水平相关，更深入的作用机制值得进一步探索.