外泌体的生物功能及临床治疗应用潜能

王含必，邓成艳

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，国家妇产疾病临床研究中心，北京 100730)

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因其极强的分化能力以及免疫调节特性，被用于组织修复和多种疾病的治疗。然而MSCs在生物活性的维持、物质定量和临床治疗的物流配送方面存在相对局限性。外泌体由于其良好的生物活性和细胞间的通讯功能，具有与MSCs类似的疗效而作为一种新的无细胞治疗选择引起了研究者的关注。早在1983年Pan及Johnstone两位学者首次报道了外泌体，他们发现在网织细胞成熟过程中，含有受体的小泡通过与细胞膜融合释放到细胞外环境中诞生了外泌体[1]。外泌体作为一种无细胞系统存在，具有一些细胞治疗不具备的优势，如体积更小、更单一、循环半衰期长、低免疫源性、很容易包被治疗物质、易穿过血脑屏障、易生产及贮存，同时无致瘤性等，使其日渐成为再生医学及生物医学治疗的新选择[2]。本文将就外泌体的来源、特征、功能及临床应用进行综述。

一、外泌体来源及特征

所有细胞都释放细胞外囊泡(EVs)，EVs携带有机化合物，包括蛋白、RNA、基因组DNA及非编码RNAs、脂质、代谢物等。细胞利用EVs系统通过化学物质与邻近和远处细胞器官进行交流。根据EVs的大小及释放机理分为三类：(1)外泌体(直径30～200 nm，平均约100 nm)；(2)微泡/核外颗粒体(100～1 000 nm)；(3)凋亡小体(50～1 500 nm)。外泌体侵入细胞传递化学信息的同时参与细胞生理及病理状态下的整合过程[3]。因外泌体直径小于光波长的5～10倍，传统光学显微镜无法检测到，但可被荧光探针标记用荧光显微镜检测。

外泌体的形成涉及到原生质膜的双重内陷和含有腔内小泡(ILVs)的细胞内多泡体(MVBs)的形成。首先浆膜内陷形成包括细胞表面蛋白与细胞外环境相关的可溶性蛋白的杯状结构，反式高尔基体和内质网也有助于早期核内体的形成。早期核内体成熟至晚期核内体，最终形成MVBs。MVBs可以与溶酶体或自噬体融合以降解，或与质膜融合以释放所含的ILVs作为外泌体。多种细胞分泌外泌体，如MSCs、上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、神经元细胞、肿瘤细胞、少突胶质细胞、B细胞及T细胞等[4]。其成分取决于来源细胞的类型及生理状态。外泌体几乎存在于所有体液中，包括血浆、尿液、腹水、乳汁等，其在生物系统中的驻留突出了它在细胞通信中的关键作用[5]。

二、外泌体的功能

既往研究认为外泌体的功能类似细胞垃圾袋，排除多余和无功能的细胞成分[6]。近年来研究显示外泌体是一种细胞间连接物，能够输送蛋白、脂质及核酸到靶细胞，在各种生物过程中发挥作用，如血管形成、抗原呈递、凋亡、炎症等。这些作用源自其转移的信息物质，从而影响生理和病理过程，包括癌症、神经退行性疾病、感染和自身免疫性疾病等[7]。外泌体通过两种途径影响受体细胞[8]，其一，外泌体和受体细胞间的配体-受体相互作用，无需将外泌体或其内容物内化到靶细胞。此途径可调节靶细胞信号通路的激活或抑制作用；其二，外泌体通过膜融合或内吞作用进入细胞，其成分被摄取后释放到细胞质中，通过调节特定的基因表达和信号通路影响宿主细胞，最终导致细胞功能或表型的改变。

1.生殖领域：受精及胚胎发育需要精确的细胞间通信。精液、羊水、血液和母乳都含有外泌体。精浆外泌体与精子成熟有关，其对人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染有抑制作用，可能通过阻断HIV早期蛋白转录激活因子的招募及HIV-1的后续转录而抑制感染[9]。外泌体也帮助预防胎盘感染，通过从胎盘滋养层的特殊细胞到非胎盘细胞的外泌体miRNA的输送，诱导自噬和防御病毒感染，如脊髓灰质炎病毒、人类巨细胞病毒及单疱病毒-1[10]。在孕妇血浆中外泌体miRNA和蛋白质含量与胎龄有关。血浆外泌体在小鼠怀孕期间也有动态变化，而妊娠期特异性外泌体在功能上与分娩有关[11]。健康母乳来源的外泌体含有与免疫功能相关的miRNA，并能在体外增强外周血来源的T调节细胞数量，可能用于调节免疫耐受[12]。外泌体还参与胚胎与子宫内膜间的信息传递，可能对胚胎发育有促进作用，且在一定程度上可反映胚胎的质量，有望成为无创性评价胚胎质量的标记物。在胚胎种植方面，研究发现胚胎来源的外泌体携带调节子宫内膜局部免疫系统的物质，在胚胎种植中也发挥调节作用[13]。

2.血管形成：血管形成包括多种生理过程，如内皮细胞及平滑肌细胞的增殖、迁移、形成管腔。外泌体参与细胞分化、新生血管形成、促进血流恢复和毛细血管网形成，提示外泌体可能成为治疗缺血性疾病的一种新的治疗方法。MSC来源外泌体可增加内膜细胞的管腔形成、促进血管形成，在裸鼠模型中皮下注射人脐带血间充质干细胞(HUMSC)来源的外泌体可显著增加体内和梗死区周围新生血管，保护心脏功能[14]，还可促进皮肤Ⅱ度烧伤后修复过程中的血管生成[15]。

3.凋亡：凋亡是细胞经历一系列变化导致死亡细胞解体，发生在健康细胞的正常周期，也发生在某些病理条件下，如炎症、感染、自身免疫和癌症。在恶性疾病中，致癌突变导致体内细胞凋亡的平衡失衡。来源于癌细胞的外泌体对自然杀伤细胞具有细胞毒性作用，并通过携带Fas配体诱导T细胞凋亡。外泌体还可通过转移具有免疫调节能力和遗传信息的物质，诱导人脐带间充质干细胞形态改变、凋亡和血栓形成，破坏细胞完整性[6]。

4.抗原呈递：在免疫方面，外泌体通过传递多种生物分子完成抗原呈递、免疫活化、免疫抑制及免疫耐受[16]。抗原呈递细胞分泌外泌体能够通过携带和呈递调节抗原特异性T细胞反应的功能性主要组织相容性复合物减轻或刺激免疫反应而达到治疗目的。树突状细胞来源的外泌体可有效诱导对寄生虫和弓形虫的保护性体液和细胞免疫应答[17]。外泌体工程实验表明外泌体中的DNA和miRNA参与调节适应免疫和先天免疫反应，如细胞内细菌(李斯特菌、嗜肺军团菌)的DNA被吸收到外泌体后刺激邻近细胞信号通路，激活免疫应答[18]，这支持了它们在治疗方面的效用以及在协调对感染性病原体或癌症的免疫反应方面的潜在作用。

5.炎症反应：炎症由白细胞启动对抗感染的免疫反应以恢复组织内稳态。外泌体参与炎症过程在许多病理状态中发挥作用，如癌症、炎症性肠病、Ⅱ型糖尿病、肥胖、类风湿关节炎等。外泌体含有的炎症趋化因子mRNA水平升高可引起炎症，其介导的炎症反应参与肿瘤发展阶段如免疫监控和治疗抵抗。来源于脂肪组织的外泌体含有55个miRNAs的改变，其中大部分调节转移生长因子β和Wnt/β-连环蛋白信号，这些信号通路调节慢性炎症和胰岛素抵抗的进程。在帕金森氏病、阿尔茨海默病和克鲁茨菲尔德-雅各布病中，细胞间通过外泌体包含的α-synuclein，淀粉样蛋白和朊病毒触发炎症信号细胞间的连接[19]。这些证据表明外泌体通过调节基因表达和细胞功能在炎症和免疫反应中发挥重要作用。

6.细胞增殖与分化：外泌体介导的分化在治疗组织损伤中发挥着重要作用，其可促进MSCs产生不同种类细胞替代受损或死亡组织中丢失的细胞。研究表明从细胞培养物中分离出的前成骨细胞外泌体可在体外和体内诱导MSCs的谱系特异性分化[20]。肿瘤来源的外泌体可诱导肿瘤细胞增殖、促进瘤变。外泌体还参与了肿瘤微环境的血管生成和细胞外基质重建，这是肿瘤生长和转移扩散的关键步骤。癌细胞分泌的外泌体促进癌症对各种化疗药物和抗体的耐药性[21]。

三、外泌体的临床应用

外泌体的复杂性为疾病的诊断和监测提供了一个多组分的诊断窗口。无论是在基础水平还是应用水平，外泌体向病变细胞运送功能物质的特性也有利于它们作为治疗载体。

(一)外泌体的诊断潜力

外泌体生成过程捕获的特异性核酸、蛋白质及脂质可反映细胞起源及其生理状态，有明显的疾病特异性，使它们成为理想的生物标记物，如阿尔茨海默病、病毒感染、癌症、肝肾疾病和心肺疾病[22]。外泌体不仅可以作为载体携带RNA，还可以保护其免受RNA酶降解。外泌体-miRNAs参与各种类型的癌症相关过程，如血管生成和转移，提示它们可视作癌症诊断的无创性生物标志物，尤其是卵巢癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌及肠癌。外泌体miR-21血清水平可用于鉴别食道鳞癌与良性疾病[23]，在肝癌中也明显高于慢性乙肝及健康人群[24]。循环中的miRNA-141和miRNA-375已被证明是诊断前列腺癌的有价值的生物标志物[25]，从人类唾液和羊水中分离出的外泌体含有数百种稳定的miRNAs，是胰腺癌和产前诊断的宝贵工具[26]。与正常组织外泌体相比，肺癌外泌体显示不同水平的miRNAs(miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200-5p)，可用于肺腺癌的筛查诊断[27]。这些数据表明外泌体miRNAs可能成为癌症和炎症疾病的早期诊断工具之一。在妇产科疾病方面，有学者研究了多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵泡液外泌体内长链非编码RNA(lncRNA)的表达，发现PCOS患者外泌体中lncRNA存在差异性表达，可能lncRNA在PCOS的发病中发挥一定作用;且外泌体中mRNA在卵泡液中的表达稳定，受内环境影响小，加之lncRNA在外泌体中有表达，有可能成为PCOS患者的早期诊断手段之一[28]。

(二)外泌体的治疗潜力

目前外泌体治疗研究主要在生物医学、药物输送及再生医学这三方面。来自MSCs的外泌体已被尝试用于多种疾病模型的研究，如呼吸、心血管、神经、肌肉骨骼、肝脏、胃肠、皮肤和肾脏疾病[29]，治疗心肌梗塞、药物成瘾、癫痫、脑损伤、肝损伤及某些类型的癌症等[30]。外泌体治疗具有特殊优势：无复制功能故无成瘤风险；有过滤杀菌作用且时效比干细胞长；体积小易通过体内循环到达损伤部位；更低的免疫源性；通过增加或抑制血管形成达到控制疾病进展或组织修复目的。

1.外泌体在生物医学的应用：很多研究关注于干细胞来源外泌体的治疗，动物器官损伤模型，如肝、肾及心脏损伤常见的纤维化改变。在肝损伤的动物模型研究中发现HUMSCs来源的250 μg外泌体直接注射入纤维化的肝脏后纤维化程度明显降低[31]。在心肌梗塞模型中可减少炎性及纤维化，且作用效果明显高于MSCs。对miRNA增殖分析后发现在外泌体及MSCs中不同的miRNAs表达明显不同，如miR-21及miR-15，这一差异可解释为什么外泌体较MSCs更具有治疗心肌梗塞的优势[32]。在急性肾衰的鼠模型中注射细胞外囊泡后发现肾小管细胞形成明显增加，在慢性肾损伤的裸鼠模型中MSCs来源的细胞外囊泡可减少纤维化和肾小管萎缩[33]。

2.药物输送：外泌体能介导遗传物质水平的转移，从而改变受体细胞的生物活性。外泌体可有效载荷多种治疗物质，包括RNAs、反义寡核苷酸、化疗药物等，且能够通过不同的生物屏障将这些物质直接输送到靶器官，如巨噬细胞来源的外泌体能够有效地穿越血脑屏障传递蛋白质类物质[34]。与脂质体相比外泌体能更有效地进入其他细胞，并能在小鼠外源性给药时以最小的免疫清除率传递功能性物质。来自间质细胞和上皮细胞的外泌体反复注射在小鼠体内不会诱导毒性。MSC来源的外泌体治疗一名移植物抗宿主的反应者显示重复注射外泌体有很好的耐受性，无明显副作用及不良反应[35]。工程外泌体上的配体富集也可用于诱导或抑制受体细胞中的信号传导，或将外泌体靶向到特定细胞。外泌体还可有效装载肿瘤的化疗药物，且毒副作用低。因此外泌体作为药物载体具有良好耐受性及应用前景。目前基于外泌体的治疗已在胰腺癌患者中开始了一期临床试验(ClinicalTrials.gov identifier：NCT03608631)。

3.再生医学：MSCs来源外泌体是再生和修复领域的一种有前途的工具，针对其再生潜力和治疗应用已进行了一些体内和体外研究，在多种疾病中已证实外泌体甚至比MSCs有更好的作用[7]，如减小心梗范围，在心肌缺血灌注损伤后预防不良重构，皮肤损伤、急性肾损伤、肝损伤、新生儿肺损伤、促进视神经挤压时视网膜神经节细胞存活、改善视网膜激光损伤、协调神经保护。研究显示皮肤损伤修复归因于胶原合成和MSCs诱导的多能干细胞分泌的外泌体[4]，在妇产科领域，Asherman’s综合征是治疗棘手的疾病。有学者构建宫腔粘连的鼠模型，采用静脉或宫腔内注射干细胞的方法治疗可促进血管形成、降低宫腔粘连程度，甚至预防粘连形成[36]。用鼠模型比较MSCs及MSCs-外泌体的疗效后发现，外泌体治疗组纤维化程度及基质金属蛋白酶抑制剂-2表达降低，基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-9表达增加，有关血管形成的CD31及VEGFR-1表达高于MSCs组，证实外泌体对改善宫腔粘连的损害效果优于MSCs[37]。有研究人脐带MSCs对子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞的影响，结果发现外泌体可增加子宫内膜腺上皮细胞的迁移，可能促进子宫内膜的修复[38]。然而，外泌体在组织再生中的作用在很大程度上仍未明确是限制其使用的障碍。

四、存在的问题及展望

目前虽然有证据支持外泌体可作为新的诊断和治疗手段，但仍需要临床验证。外泌体的分离和纯化存在一定的局限性。为了达到有效的剂量至少需要10～100 g的外泌体，然而1 ml培养基的产率通常小于1 μg[39]。此外，从生物体液中分离出来的外泌体高度异质且纯度低，优化分离纯化外泌体的方法是关键，在保持其原始组成的同时要减少由污染物或特定亚群引起的不良副作用，以提高其治疗效果[40]。一旦这些限制被克服将有助于我们加深对外泌体功能的了解，并将促进新的治疗策略的发展。