肿瘤血管生成拟态的影像学研究进展

刘日 郑建军 张景峰

血管内皮来源的新生血管一直被认为是肿瘤获得血液供应的唯一途径。1999 年，Maniotis 等［1］在葡萄膜黑色素瘤中发现了一种类血管结构，其管壁由肿瘤细胞直接围绕而成，管腔内见红细胞且腔面无内皮细胞覆衬。由于该结构较之传统肿瘤血管完全不同，因此这种具备血管功能、但无内皮细胞参与的管道结构被命名为血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）。此后20 多年时间里，陆续在20 多种恶性肿瘤中发现VM 结构［2］。在恶性肿瘤患者中，VM 往往与不良预后相关［3］，并且在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用［4］。目前评价VM 的金标准为取肿瘤组织进行病理CD31 联合PAS双重染色［5］，但因其有创性、取材局限性等缺点，无法在临床大规模开展。影像技术的发展为非侵入性定量评估肿瘤VM 提供了技术支持。

VM 概念的更新

自从1999 年被首次报道以来［1］，VM 的存在一直是一个极具争议的问题。现有文献一致认为，在高侵袭性肿瘤中常能观察到VM，且VM 与患者低生存率密切相关。顾名思义，VM 应当具备类似血管的功能：氧气供应、营养运输和代谢物排泄。这些都是高侵袭性肿瘤发生早期转移所必需的功能。最近，术语VM 已扩展为包含任何不含内皮细胞的流体结构。已知巨噬细胞可支持血管生成，但不能直接形成血管壁，但2016 年一项研究颠覆了这一观点，Barnett 等［6］在小鼠皮下基质胶血管生成试验和小鼠黑色素瘤皮下种植模型中均观察到巨噬细胞参与了VM 形成。令人意外的是在非肿瘤组织中依然能观察到非内皮依赖的类血管结构。最近有研究报道，在大鼠胎盘形成之前，滋养层细胞会渗入子宫壁，并形成类似于VM 的无内皮管状结构［7］，表明VM 可能在妊娠初期负责血液和营养供应。

VM 组织学特点

从功能上看血管、淋巴管和VM 均具有传导流体的能力，但在组织结构上具有明显差异。传统血管内腔覆衬有单层内皮细胞，其外围环绕连续的基底膜，后者外层附有周细胞。淋巴管内腔同样覆衬有单层内皮细胞，其外围环绕更薄且不连续的基底膜，后者外周无周细胞附着［8］。在经典VM结构中，内腔无内皮细胞覆衬，管腔由富含糖蛋白的基底膜直接围绕而成，后者外层由肿瘤细胞环绕而成［9］。在微观层面，可以根据结构和成分差异来识别和区分血管与VM（图1）。

有研究者按结构特征将VM 分为1 型［10］和2型［11］。1 型称之为管型VM，形态上为类似血管的管状结构，管壁直接由肿瘤细胞构成，管腔侧无内皮细胞附衬，管腔连接肿瘤新生血管，红细胞漏出和微血栓少见。2 型称之为图案样基质型VM，无典型管腔样结构，由围绕肿瘤细胞簇的细胞外基质层构成环网结构，较之管型VM 可以为肿瘤组织提供更大的扩散表面积［12］。VM 管道内衬基底膜，过碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）染色呈阳性，同时其内层无内皮细胞覆衬，因此血管内皮细胞特异性标记（CD31 或CD34）染色呈阴性［13］。众所周知，肿瘤细胞会分泌大量黏蛋白，这些黏蛋白PAS 染色呈阳性，但这并不意味着肿瘤细胞能形成管状结构，因此Valdivia 等［14］建议除了传统CD31 染色阴性PAS 染色阳性之外，在管腔结构内发现红细胞也应是评判VM 的重要指标。最近，有体外研究表明PAS 阳性区域也可能代表与VM 不相关的非功能性结构［9］。于是，有质疑者认为仅靠PAS 阳性染色不能保证VM 的存在。因此，在缺乏可靠的VM 生物标记物的情况下，“PAS 阳性/CD31 阴性”、“边界清晰的管腔结构中发现红细胞”两者相结合为目前评判VM 的金标准。

VM 发生机制

VM 形成过程复杂，涉及肿瘤干细胞、肿瘤微环境、上皮-间质转化等多种机制。

1.肿瘤干细胞

肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是指肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。越来越多的证据表明，CSCs 参与了VM的形成。基因型的改变导致肿瘤细胞自身将呈现出多潜能干细胞表型，分化成内皮样细胞［1,15］，参与形成VM，其整个过程无内皮细胞的参与［16］。VM 能增加肿瘤组织的血液灌注，使肿瘤细胞获得氧气与营养物质的同时带走代谢产物，最终促进肿瘤进展与转移［1,17］。在胶质母细胞瘤中，内皮细胞标记物CDH5 在CSCs 中被特异上调，但在非CSCs 中不被上调。近期有研究发现ALDH 阳性细胞（一种CSCs 亚群细胞）在体外基质胶培养24 h即可观察到VM 结构，而ALDH 阴性细胞则没有，表明CSCs 在VM 形成过程中起重要作用［18］。

2.微环境

缺氧：大量证据支持缺氧在维持CSCs 干细胞样表型、促进肿瘤侵袭转移和VM 中的作用［19］。已有报道称缺氧能够诱导黑色素瘤、肝细胞癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌的VM 形成［20］。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是人唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）组织中低氧诱导的VM 的关键下游效应子。此过程由上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和CSCs［21］调解。此外，缺氧诱导因子-1 （hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）通过直接调节VEGF-A、VEGFR1、EphA2、Twist、Nodal 和COX2 的表达或间接调节VE-钙黏蛋白和TF 的表达而参与VM 的形成。例如在肝细胞癌中，缺氧导致肿瘤细胞HIF-1α 上调，HIF-1α通过赖氨酰氧化酶的上调诱导VM 形成，并促进肿瘤细胞的转移和进展［22］。

巨噬细胞：一般普遍认为巨噬细胞能直接杀死肿瘤细胞，但有文献报道在胶质母细胞瘤中，M2 型巨噬细胞可以通过PGE2/EP1/PKC 途径以COX-2 依赖性方式促进VM形成［23］；M2 型巨噬细胞通过PKC 途径放大IL-6 分泌来促进VM 形成［24］。这一发现颠覆了人们对巨噬细胞在抗肿瘤免疫中的传统印象。

肿瘤相关成纤维细胞：肿瘤相关成纤维细胞（tumor-associated fibroblasts，TAFs） 通过各种信号通路参与恶性肿瘤的肿瘤血管形成与VM 形成［25,26］。Yang 等［27］研究表明，肿瘤相关成纤维细胞条件培养液（conditioned medium TAFs，CM-TAFs）可通过分泌TGF-β 和基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF1）在体外的情况下促进肝细胞癌VM 形成、VE-钙粘素、基质金属蛋白酶-2 和层黏连蛋白5（laminin-5，LN-5）mRNA 2 的表达上调。近期有报道称TAFs 通过EphA2-PI3K 信号通路调节胃癌的VM 形成［28］。

3.上皮-间质转化（EMT）

VM 中的肿瘤细胞具备源自EMT 的间充质细胞的以下特征：上皮标记物（如细胞角蛋白）下调，细胞极性丧失（如E-钙黏着蛋白、闭合蛋白）和间充质细胞标志物（如VE-钙黏蛋白、波形蛋白、N-钙黏蛋白、纤连蛋白）的上调［29,30］。VE-钙黏蛋白在VM 形成过程中起重要作用，肿瘤细胞通过表达VE-钙黏蛋白促进EMT，后者有利于VM 形成和肿瘤转移［31,32］。EMT 促进VM 形成涉及大量信号传导途径，如TGF-β 信号通路［29,33］、Wnt 信号通路［34,35］和Notch 信号通路［2］。此外，有两个miRNA 调节网络被认为在表观遗传上调节EMT，包括miR34-SNAIL1 和miR200-ZEB1［33］。

VM 临床意义

VM 与肿瘤的生长、进展、转移、侵袭和抗肿瘤血管治疗失败密切相关，其已被证实为多种恶性肿瘤不良预后的独立预测因子之一，较之VM 阴性肿瘤患者，VM 阳性肿瘤患者的预后更差，5 年生存率更低［24,36,37］。因此准确识别并定量分析VM对于临床至关重要。目前VM 定量分析主要依据病理组织切片的PAS/CD31 双重染色来计算VM密度（vasculogenic mimicry density，VMD）。但近来有学者报道，在前列腺癌中，VM 与组织学分级之间几乎不存在相关性，作者解释其可能原因为前列腺组织中富含平滑肌纤维引起染色结果的异常［38］。

目前，临床尚无针对VM 的特定疗法，但已有学者致力于抗VM 药物的研发。有研究者使用PTD（HIV-1）肽修饰的脂质体转运不同靶标的化合物（表柔比星和塞来昔布）对裸鼠MDA-MB-435S 人乳腺癌模型进行治疗，较之对照组经脂质体修饰的药物在体循环时间延长，并在肿瘤部位持续积累，组织学检查表明肿瘤组织中的VM 和血管生成明显降低［39］。近来针对VM 的单克隆抗体也已有报道，该抗体能靶向结合VE-钙黏蛋白的EC4 结构域，抑制VM 中VE-钙黏蛋白相关途径的激活，最终抑制了3D 基质胶体外培养的肺癌Glc 82 细胞的增殖和VM 形成［40］。

VM 影像学评估新进展

VM 与肿瘤的转移和不良预后密切相关，因此对其早期检测及定量评估具有重要的临床实际意义。目前定量检测VM 的主要方法仍然是病理组织学检查，因其有创性、取材局限性且无法进行功能评估等缺点，并不是一种理想的检查手段。目前迫切需要非侵入性方法来评估体内肿瘤的VM。而B 超、CT 和MRI 已被广泛应用于动物和人类的无创性血管成像［41］，由于VM 是功能性管道，并能与血管沟通，从理论上讲，对比剂可进入VM管，具备利用影像技术进行无创性检测的可能。

1.分子成像

分子成像依靠特定的靶向对比剂可以在活体的分子/细胞水平上显示生理过程。脉络膜黑色素瘤的微循环被证实有VM 参与，已有学者在分子成像领域对VM 进行探索。1998 年，Mueller等［42］通过吲哚菁绿血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）证实脉络膜黑色素瘤的VM 中存在ICG。同样Frenkel 等［43］对9 例脉络膜黑色素瘤患者进行了ICGA，他们观察到在静脉注射吲哚菁绿后12 min 内，肿瘤组织的VM 内的荧光强度逐渐衰减，但在ICG 注射后1 min 内抽出的血液在4 周后仍然持续发出荧光。这间接证明VM 可能是较内皮依赖血管系统更高效的药物传递途径。Liu 等［44］将聚乳酸纳米颗粒与抗人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）抗体结合，在体外证明了使用靶向纳米颗粒增强超声成像的可行性，因为VM 的管壁由肿瘤细胞直接构成，该技术有望应用于对HER 阳性的乳腺肿瘤的VM 进行成像。

2.磁共振成像

Shirakawa 等［45］使用WIBC-9 及MC-5 肿瘤细胞分别构建侵袭性、非侵袭性乳腺癌裸鼠模型，使用大分子MRI 对比剂G6D-（1B4M-Gd）256，通过MRI 动态灌注增强扫描评价肿瘤血流，处死取病理切片染色发现两种类型的肿瘤在肿瘤外围均存在VM 结构，侵袭性肿瘤细胞在肿瘤中心形成VM结构，而非侵袭性细胞则显示核心坏死，前者瘤内强化速度、最大信号强度均明显高于后者。Yamamoto等［46］报道了一例疑似脑海绵状血管畸形的患者，术后组织学诊断为间变性少突胶质细胞瘤、VM、脑海绵状血管畸形，其术前增强快速稳态进动采集（fast imaging employing steady-state acquisition，FIESTA）序列显示轻微强化区域与HE染色VM 区域一致。

3.超声检查

超声对比剂是一种含有微小气泡的液体，其进入血管后，对比剂中的微气泡在超声作用下会发生振动，获得增强的背向散射信号。随着材料学的不断进展，使超声微泡对比剂的直径达到微米级别的新高度（小于8 μm），这个大小的对比剂能顺利通过肺循环最终到达靶器官/靶组织。

已有学者在血流动力学方向对VM 进行了一系列研究。Zhou 等［47］使用腹腔注射沙利度胺治疗H22 肝癌小鼠模型，在治疗后第8 天行对比增强超声检查（contrast-enhanced ultrasound，CEUS），分析超声灌注图像并与免疫组化分析微血管密度（microvessel density，MVD） 进行对照，发现MVD与IMAX 和AUC 正相关，提示CEUS 能监测肿瘤对抗血管生成治疗的反应，但由于该研究中MVD测量并未区分内皮血管与VM，其MVD 实际反映了肿瘤中内皮血管和VM 的平均密度，其结论自然存在缺陷。就此最近Zhou 等［48］利用CEUS 评估H22 肝癌小鼠模型肿瘤的VMD，发现VM 密度与上升时间（rise time，RT）、达峰时间（time to peak，TTP）和平均度过时间（mean transit time，mTT）正相关，提示CEUS 为非侵入性评估在体肿瘤VM提供了新的技术手段。

2020 年Liu 等［49］报道VEGFR1 和VM 相关的蛋白质在体内和体外MUM-2B 黑色素瘤细胞中高表达，并合成一批以VEGFR1 为靶点的CEUS靶向对比剂（VEGFR1 MBs），并将其用于小鼠黑色素瘤模型的CEUS 成像。作者通过体外实验证实靶向对比剂VEGFR1 MBs 特异性地与MUM-2B黑色素瘤细胞结合。然后通过比较靶向和非靶向CEUS 成像之间的MUM-2B 黑色素瘤灌注参数发现，与对照组相比，VEGFR1 MB 组在肿瘤微循环中的积累显著增加，VEGFR1 MBs 组的肿瘤区域IMAX 和mTT 显著高于对照组，但两组之间的RT没有显著差异。

4.光声断层成像

光声断层成像（optoacoustic tomography，OT）是一种新兴的成像方式，结合了光学成像高对比度与超声高空间分辨率力的优点［50］。OT 对氧合和脱氧血红蛋白、脂肪组织和水含量具有内在的敏感性，因此具有描述肿瘤血管生成的潜能［51］。

Quiros-Gonzalez 等［52］利用多光谱OT（multispectral OT，MSOT）对雌激素依赖性（MCF-7）和非雌激素依赖性（MDA-MB-231）原位乳腺癌异种移植裸鼠模型进行检测，计算肿瘤的总血红蛋白（total hemoglobin，THb）和氧饱和度（SO2MSOT），随后取肿瘤组织进行血管表型的病理生化评估。结果发现MDA-MB-231 肿瘤的SO2MSOT明显降低，且边缘-核心差异很大，而MCF-7 肿瘤在边缘和核心都显示出类似于健康组织的SO2MSOT。离体分析显示MCF-7 中观察到的血管生成过程与血管生成一致，而MDA-MB-231 似乎更多地依赖于VM，表明OT 有助于鉴别肿瘤血管表型的差异。

小 结

在恶性肿瘤患者中，VM 往往与不良预后相关，并在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要作用。影像技术的发展为非侵入性定量评估肿瘤VM 提供了可能，目前关于VM 的影像学评估尚缺乏统一标准，并且大多数有关VM 影像学评估研究仅限于动物试验阶段。而现阶段尚缺乏将VM 与肿瘤新生血管区分开的特异性分子靶点，这可能是未来VM 分子影像研究的方向之一。