辛芷滴鼻液、烧烫宁膏微生物限度检查方法的研究

王艳　刘光斌　金文丽　何苗苗　谢静

 研究探索辛芷滴鼻液、烧烫宁膏两种含中药的制剂微生物限度检查法，进一步做方法学验证。用平皿法进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数;用常规法进行控制菌检查。 5种试验菌株回收率值在0.5〜2范围内，满足《中国药典》2015版四部微生物限度检查法方法验证试验的要求。 本研究建立的方法操作简便，可用于两种制剂的微生物限度检查。

：辛芷滴鼻液;烧烫宁膏;微生物限度检查;验证

辛芷滴鼻液是酒钢医院研制的用于治疗慢性、萎缩性、过敏性鼻炎的一种含中药滴鼻剂;烧烫宁膏用于治疗Ⅰ、Ⅱ度以下烧烫伤。鼻炎症状严重影响患者的身心健康和生活质量，尤其是在西北寒冷地区，气候干燥，昼夜温差大，鼻炎发病率高，给患者带来不可忽视的生活困扰，为此我院根据中医理论和临床实践经验专门研发了便于使用和携带的中药滴鼻剂辛芷滴鼻液，臨床反应疗效明显。而烧烫宁膏则是针对轻度的烧烫伤治疗的一种必要的补充制剂，满足临床需求。这两种制剂中均含有不同成分的中药提取液，因此在对其进行微生物限度的质量检查过程中，应先查验中药成分是否具有抑菌性，从而建立有效的微生物限度检查方法。由于这两种制剂均为油性制剂，辛芷滴鼻液以麻油为基质，烧烫宁膏则是油性软膏，本文在对这两种制剂进行微生物限度检查方法验证时，尝试了不添加乳化剂进行样品的稀释处理，而是用45 ℃保温溶解，简化操作步骤，同时也避免了乳化剂对试验菌的干扰，实验结果满意，现报道如下。

 

辛芷滴鼻液，规格：10mL/支，批号：20190702、20190806、20190904;烧烫宁膏，规格：20 g/支，批号：20190507、20190616、20191010;均由酒钢医院制剂室生产。

pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（稀释液）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、溴代十六烷三甲铵平板（CA）、甘露醇氯化钠琼脂平板（MSA），麦康凯液体和琼脂培养基，均来源于青岛海博。其他试剂均为分析纯或化学纯。

金黄色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]（菌J）、铜绿假单胞菌[CMCC （B） 44104]（菌T）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]（菌K）、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]（菌B）和黑曲霉[CMCC（F）98003]（菌H）、大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]（菌D）购于中国食品药品检定研究院。以上菌株传代次数不超过5代。

电子天平（YP5002，上海佑科）、压力蒸汽灭菌器（上海三申）、细菌培养箱（LRH-80F，上海）、霉菌培养箱（MJX-80S，上海）恒温水浴锅、超净工作台（上海）、生物安全柜（BIOsafe12，上海力申）等。

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接种菌J、菌K、菌T的新培养体至TSB中，培育18～24h，用稀释液配成每lmL含5000〜10000cfu、500〜1000cfu、50〜100cfu的菌悬液：接种菌B的新培养体至SDB中，培育24～48h，用0.9%等渗无菌盐水配成lml含5000-10000cfu， 500〜1000cfu、50〜100cfu的菌悬液。接种菌H的新培养体至SDB中，培育5〜7d，加入3-5ml 0.9%等渗无菌盐水，洗掉孢子后，缓缓吸取带孢子的悬液（使用无菌纱布滤过菌丝）至无菌试管内，用0.9%无菌氣化钠谘液稀释制成每1mL含孢子数5000〜10000cfu、500～1000cfu， 50〜100cfu的孢子悬液。各菌种、菌悬液均不过5代。

辛芷滴鼻液：取辛芷滴鼻液10mL至无菌容器中，倾入45 ℃的稀释液至100mL，溶解，混匀，制成1：10供试液。

烧烫宁膏：取烧烫宁膏10 g至无菌容器中，倾入45℃的稀释液至100mL，溶解，混匀，制成1：10供试液。

（1）试验组：取“2.2”下的供试液9.9 mL，加入菌J的菌液0.1mL，混匀，使l mL含菌量不超过100 cfu，吸取1ml加到无菌平皿中，随即注入TSA。同法制备含菌K、菌T、菌B、菌H的供试液，各取1 mL同菌J操作。另外各取含菌B和菌H的供试液1 mL加到洁净平皿中，随即注入SDA。每种试验菌株各平行制备2个平皿。 。

（2）供试品对照组：取1：10的样品溶液，用缓冲液替代菌液同试验组同法操作。

（3）菌液对照组：取稀释液替代供试液，同试验组试验，添加各试验菌。

（4）阴性对照组：用同批配制、灭菌的TSB 1ml替代供试品溶液，同试验组进行操作。

验证试验分3次独立完成，各试验组分别采用上述供试品平行做3次。

各菌落计数方法按下式计算，回收率（R）=（试验组平均菌数-供试品对照组平均菌数）/菌液对照组平均菌数。若0.5≤R≤2，则该法可行。若任何一次试验中R<0.5，则该法不适宜。

辛芷滴鼻液与烧烫宁膏试验结果均为R>0.5，说明该方法可行。试验结果见表1、表2。

取“2.2”下的辛芷滴鼻液、烧烫宁膏1：10供试品溶液一次进行菌J、菌T及菌D的方法适用性检查，结果按常规法可以检出试验菌相应反应特征。

辛芷滴鼻液和烧烫宁膏是酒钢医院根据临床需求研制的医院制剂，在临床应用中发挥了积极作用。由于这两种制剂都含有中药成分，辛芷滴鼻液中含有辛夷、白芷等四味中药;烧烫宁膏则含有紫草，黄芩等5味中药。根据2015年版《中国药典》的要求，所有制剂均应进行微生物限度的檢查，查阅各文献，研究我院制剂微生物限度检查方法对保证制剂质量意义重大。中药原料来源多样，微生物污染情况复杂且不易控制，而且有些中药本身又有不同的抑菌性，若不进行方法验证，将会导致微生物限度检查结果不实。所以，验证确定适宜的微生物限度检查方法，将有效提高医院制剂的安全性和有效性。而本法的验证结果表明辛芷滴鼻液和烧烫宁膏中所含的中药成分均对试验菌没有抑制作用。

2015版《中国药典》对油脂类供试品的处理方法是取供试品，添加灭菌的十四烷酸异丙酯，或少量无抑菌性的乳化剂、表面活性剂促溶解。这些都是化学方法促溶，有潜在的干扰性，本实验中的两种制剂均为油脂类，在对供试品溶液制备过程中，笔者使用了水浴45℃加温的物理方法促使供试品溶解，充分混匀，没有加乳化剂，实验结果表明，各菌回收率均在0.5～2，即用45 ℃水浴加温溶解油脂性供试品可行，此方法较加入助溶剂更易操作，步骤简单，更有利于日常的检验操作，同时也避免了添加剂的干扰因素，本法的验证结果也为在微生物限度检查过程中如何处理油性供试品提供了一种新的思路。寻找简单有效且符合药典要求的处理方法是很有必要的。

2015版《中国药典》对鼻用制剂控制菌的限度要求除了不得检出菌J和菌T之外，还不得检出菌D，本文也针对控制菌做了方法验证，均能按常规方法检验。

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