山楂果醋混合菌种发酵工艺及香气成分的HS-SPME/GC-MS分析

邢晓莹，于迪，乔羽，范振宇，王如福*

(1.山西农业大学 园艺学院，山西 晋中 030801；2.太原师范学院 生物系，山西 晋中 030619; 3.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801)

山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)，又名红果、山里红，为蔷薇科(Rosaceace)山楂属(CrataegusL.)植物。根据中医理论山楂是一种食味酸甘的水果，富含VC、糖类、多种有机酸、色素(包括花青素、类黄酮和酚类物质等)等营养成分[1]，具有药食同源性。花青素作为一种抗氧化剂，可以降低血脂、炎症及癌症发病率[2-4]。山楂中的总黄酮类成分可促使心血管扩张，冠状动脉血流量增加，产生降血压作用。人们的消费观念正逐渐由传统的山楂片、山楂糕向山楂果饮、山楂果醋转变，而山楂果醋通过发酵加工不仅保持了山楂原有的果香气味和营养价值，而且拥有鲜艳的色泽及食醋的保健功能，受到消费者的喜爱[5]。

发酵食品独特的风味与参与其发酵的微生物群落密不可分[6]，目前现有的发酵型山楂醋多为自然发酵和人工接种发酵。自然发酵是不添加发酵剂，直接利用空气中及水果表面携带的菌种进行发酵，此方式操作简便，但发酵周期长、效率低、过程不易控制，难以满足人们的需求。人工接种发酵可缩短发酵周期，不受杂菌污染，但接种的菌种多为单一醋酸菌菌株，制成的山楂醋口感单一。顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱(HS-SPME/GC-MS)联用技术因操作简单、灵敏度高、无二次污染等优点广泛应用于椪柑、山楂、海棠果、砂梨等果醋挥发性香气成分的分析中，提供了一定的理论基础[7-10]。

多菌种发酵不仅能在一定程度上提高原料的利用率，还能缩短发酵周期，改善产品的营养品质。近几年，有研究混合菌种发酵苹果醋、桑葚果醋、柿果醋的报道[11-13]，但应用于发酵山楂果醋目前鲜见报道。本试验利用从山西老陈醋中分离得到的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌，采用混合菌种发酵技术对山楂进行深加工，开发与研制山楂果醋，并测定了醋样的挥发性香气物质，以期为山楂果醋的香气特征研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂：产自山西省果树研究所，采摘当天运抵实验室，分选、清洗备用；高活性干酵母：安琪酵母有限公司产品；醋酸菌(中科AS1.41)：中国普通微生物菌种保藏管理中心；乙醇假丝酵母(申请专利，保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心)、巴氏醋杆菌和戊糖片球菌：均由山西农业大学食品学院山西老陈醋研究室提供。

果胶酶、芦丁、抗坏血酸、偏重亚硫酸钾：均为国产分析纯试剂；蔗糖：市售。

1.2 仪器和设备

DS-1实验室组织捣碎机 上海昂尼仪器仪表有限公司；STARER 3100酸度计 上海奥豪斯仪器有限公司；DL-CJ-1ND无菌超净工作台 北京东联哈尔仪器设备有限公司；TRACE-ISQ型气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪 赛默飞世尔科技有限公司；VF-5MS型色谱柱、Varian 8400型固相微萃取进样器、75 μm聚二甲基硅氧烷萃取纤维头、20 mL顶空进样瓶 美国Supelco公司；发酵罐(自制)。

1.3 试验方法

1.3.1 山楂果醋的酿造工艺

山楂→去核→打浆→酶解→调糖与pH→巴氏杀菌→酒化→醋化→过滤→调配→灌装→巴氏灭菌→检测→成品。

1.3.2 操作要点1.3.2.1 山楂打浆及酶解处理

选择新鲜无病的成熟山楂，用清水清洗干净，去核后，称重5 kg，按照山楂质量比1∶3加水，加入0.01%的偏重亚硫酸钾和0.1%的抗坏血酸组成的复合护色液。将山楂汁搅拌均匀，80 ℃灭菌20 min。冷却至室温后转入20 L的发酵罐中，加入果胶酶，酶制剂用量为果浆质量的0.1%～0.15%，即5～7.5 g，温度25～30 ℃，搅拌均匀，静置8～10 h。

1.3.2.2 调整糖度和pH值

将蔗糖熔化成的糖浆煮沸杀菌后加入果浆中，使糖度达到14 °Bx，根据酵母菌发酵要求，用NaOH溶液调整 pH 值至3.5～4.5。

1.3.2.3 酒化

取100 mL温水(35～40 ℃)，加入安琪酵母搅拌至溶解。将活化后的乙醇假丝酵母和安琪酵母按2%和1%的比例接种于处理好的山楂汁中混合均匀，用4层干净的纱布封口发酵24 h。前2 d有氧发酵，期间搅拌2～3次，之后的13 d封口进行无氧发酵。

1.3.2.4 醋化[14]

将上述发酵液过滤，均分，取其中6份，分别接种中科AS1.41(10%)或山西老陈醋醋醅中分离的巴氏醋杆菌(5%)和戊糖片球菌(5%)，每组3个重复，发酵时间5～8 d。另取3份过滤后的发酵液，准备麸皮、谷糠、稻壳，和原料按1∶0.9∶0.5∶0.2的比例混合。向酒精发酵液中缓慢加入辅料，混匀后按10%的接种量接种山西老陈醋种醅，发酵9 d，期间每天倒缸一次。发酵结束后，按1∶3加水淋醋。试验所用的发酵容器、纱布、恒温振荡培养箱等在使用前均已进行彻底杀菌处理。恒温振荡培养箱的摇床转速固定为150 r/min。

1.3.2.5 调配

发酵完成后，过滤得到澄清液，用蜂蜜、山楂果汁、蔗糖调制成口感良好、风味独特的山楂果醋。

1.3.2.6 过滤、杀菌、灌装

调配好的山楂经0.02 μm的滤芯除菌过滤，在60～70 ℃下加热15～20 min进行巴氏杀菌，最后静置陈酿一段时间，经检验合格进行无菌灌装。

1.3.3 理化指标分析

还原糖的测定：参照GB/T 15038-2006中的斐林试剂滴定法；总酸的测定：参照GB/T 15038-2006中的酸碱滴定指示剂法；黄酮的测定：参照滕晓弘的试验方法；酒精度的测定：采用蒸馏法。

1.3.4 样品预处理及SPME-GC-MS联用分析条件

采样前先将萃取头插入GC-MS的进样口中，于250 ℃老化并进行空白试验，直至无色谱峰出现。准确移取6.0 mL经滤膜过滤后的山楂醋样置于20 mL顶空瓶中，再按0.20 g/mL的质量浓度加入NaCl溶解，加盖密封。将进样瓶放入孵化炉，孵化炉搅拌速度100 r/min，孵化温度为45 ℃保持10 min。将老化的SPME萃取头插入顶空瓶中，使之与液面保持1.5 cm的距离，推出萃取头，顶空吸附40 min。萃取后直接进样，在进样口温度250 ℃解吸5 min。

色谱条件：VF-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；载气为氦气(He)；流速：1 mL/min；分流比5∶1；进样口温度：250 ℃；程序升温：起始温度40 ℃保持8 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以8 ℃/min的速度升至240 ℃保持10 min。质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)；接口温度280 ℃，离子源温度250 ℃，溶剂延迟时间1.5 min，电子能量70 eV，质量扫描范围43～500 amu。

1.3.5 数据处理

检索谱库为Willey谱库和美国国家标准与技术研究院(national institute of standards and technology，NIST)谱库，结合相关文献及化学成分的保留时间、质谱图谱和匹配度>80%等进行定性分析。采用峰面积归一化法进行简单定量，求得各挥发性成分的相对含量。试验其他数据采用Excel 2003数学软件和SPSS 19.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 酒化阶段还原糖、酒精度的变化情况

酒化发酵前期会有大量泡沫产生。有研究表明[15-16]，发酵温度在28～36 ℃范围内对酒精产量影响不大。较低的发酵温度不仅有利于风味物质的形成，还降低了发酵过程中污染杂菌的几率，因此酒化发酵温度设置为28 ℃。

图1 酒化过程中还原糖和酒精度变化情况Fig.1 The changes of reducing sugar and alcoholic strength during alcoholization fermentation

由图1可知，随着酵母菌的增殖代谢，发酵液酒精度呈不断上升的趋势，而还原糖含量逐渐下降。酒化前2 d是有氧发酵，酵母菌处于增殖时期，发酵液中的酒精含量较少；从第3天开始进入主发酵期，醪液中糖分迅速下降，酒精含量不断积累；从第13天开始至发酵结束，酒精度和还原糖含量的变化趋于平缓，此时基本发酵完全。酒化结束时，发酵液的酒精度为8.3%，之后按照工艺流程接种醋酸菌、乳酸菌或醋醅进行醋酸发酵。

2.2 醋化发酵液(醋醅)理化指标的测定与分析

静置发酵温度设置为25 ℃和30 ℃，摇床(恒温振荡培养箱)发酵的温度控制在30 ℃，发酵时间6 d。醋酸发酵是有氧发酵，在摇床发酵条件下，菌种与发酵液、氧气充分接触，迅速增殖并积累大量代谢产物。

图2 AS1.41单一菌种醋化发酵结束时各指标的含量Fig.2 The content of each index at the end of acetification fermentation with single AS1.41

由图2可知，采用AS1.41纯菌种进行醋酸发酵时，总酸、不挥发酸及氨基酸态氮在摇床条件下的含量远高于其他两种发酵条件，同时摇床发酵液中的还原糖含量最低。静置条件下，缓慢进行醋酸发酵的山楂醋比摇床发酵的样品含有更多的酯类，为1.69 g/dL。氨基酸态氮的增长来源于微生物对原料中蛋白质的水解。由于氨基酸是两性物质，是很好的天然缓冲盐，其含量的增加可以增强发酵体系的缓冲能力，利于稳定体系的pH值，使发酵顺利进行。

接种混合菌种进行醋酸发酵，待发酵结束时对其进行各理化指标的测定，见图3。

图3 混合菌种(巴氏醋杆菌、戊糖片球菌)醋化发酵结束时各指标的含量Fig.3 The content of each index at the end of acetification fermentation with Acetobacter pasteurianus and Pediococcus pentosaceus

由图3可知，摇床条件下混菌发酵液的总酸最高，为4.29 g/dL，略低于纯菌种发酵，但混菌发酵液的不挥发酸和总酯含量却高于纯菌种发酵。摇床发酵条件下，混菌发酵液的不挥发酸比AS1.41发酵液的提高了0.16 g/dL；静置发酵条件下，混菌发酵液的总酯含量比纯菌种发酵液的提高了16.57%。接种乳酸菌在增加山楂果醋的不挥发酸含量的同时，其发酵糖类产生的乳酸与琥珀酸、柠檬酸等有机酸及各种酯类物质还能缓解因乙酸含量高而导致的刺激酸味，使果醋酸味柔和、醇厚。在乳酸菌和醋酸菌的共同作用下，发酵液的残糖量较低，说明混菌发酵比纯菌种发酵能提高原料的利用率。

图4 醋醅固态发酵结束时各指标的含量Fig.4 The content of each index at the end of solid-stated fermentation with fermented grains

在固态发酵结束时，对醋醅取样进行理化指标测定。由图4可知，醋化完成后，醋醅的总酸、不挥发酸、总酯含量均高于纯种发酵及混菌发酵，分别为5.26，0.82，2.39 g/100 g。完成酒化过程的发酵液在制醅时拌入大量的麸皮、谷糠、稻壳等，辅料的加入不仅提供了丰富的营养物质，同时也带入了大量的微生物及酶系，它们与空气中和种醅中的微生物互生、拮抗，共同完成醋化与酯化过程。在醋醅发酵过程中，主要的菌群是醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等细菌，真菌的数量较少，所有菌群随着发酵过程的推进均逐渐进入残留期。产酸菌代谢产生乙酸、乳酸、柠檬酸等酸类物质及其他次生代谢产物，芽孢杆菌产生的高活性的蛋白酶、淀粉酶，从而将蛋白质、淀粉等大分子物质水解成氨基酸、葡萄糖、糊精、麦芽糖等产物。同时酸和醇在酯化酶的作用下结合生成酯。固态醋醅的环境有利于酯类化合物的形成[17]，醋醅的含水量约为60%，发酵时间长且反应较完全，故而酯类物质形成较多。代谢产物的种类在此发酵体系中比较丰富，产物之间又相互转化、补充，共同构成产品独特的风味。

2.3 顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)分析结果

采用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)对3种山楂果醋样本的香气成分进行分析，总离子流色谱图见图5。

图5 山楂醋香气成分总离子流色谱图 Fig.5 Total ion chromatograms (TIC) of aroma components of hawthorn fruit vinegar analyzed by GC-MS

各组分质谱分析结果中挥发性成分及各物质百分含量见表1。

表1 山楂果醋的挥发性成分分析结果Table 1 The SPME-GC-MS analysis results of volatile components of hawthorn fruit vinegar

续 表

AS1.41发酵的果醋中共鉴定出30种挥发性香气成分，其中酸类9种，占易挥发成分总量的37.56%；醇类5种，占总峰面积的16.12%；酯类8种，占总峰面积的30.16%；醛类4种，占总峰面积的4.86%；酮类1种，占总峰面积的0.06%；酚类1种，占总峰面积的0.29%，其他化合物占总峰面积的2.26%。混菌发酵的果醋中挥发性香气成分经质谱分析出43种物质，其中酸类10种，相对含量为33.46%；醇类9种，相对含量为16.48%；酯类11种，相对含量为37.71%；醛类5种，相对含量为6.19%；酮类1种，相对含量为0.06%；酚类1种，相对含量为0.36%，其他化合物的相对含量为3.40%。接种醋醅发酵的山楂果醋中挥发性香气成分经质谱分析出52种物质，其中酸类11种，相对含量为32.97%；醇类11种，相对含量为18.16%；酯类12种，相对含量为39.87%；醛类6种，相对含量为6.41%；酮类2种，相对含量为0.25%；酚类2种，相对含量为0.42%，其他化合物的相对含量为3.57%。

2.4 山楂果醋香气成分分类分析

酸味是果醋成品中最突出的成分，直接影响产品的风味和品质。由表1可知，乙酸、5-氨基颉草酸、3-羟基丁酸、己酸在3种山楂果醋挥发性成分中均存在，而且在酸类物质中占较高的含量；其他酸类物质如正戊酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、辛酸，也是3种山楂果醋中所共有的，其含量相对较低。己酸具有干酪味、少许的酸臭味，辛酸具有奶酪味、少许涩味，而3-羟基丁酸、异丁酸等则略带刺激性气味。低浓度的酸会赋予果醋清淡的、令人愉快的香味，但浓度过高时会对果醋香气品质产生消极的影响。4-甲基-2-氧戊酸在混菌发酵和醋醅中被检测到；异戊酸仅存在于醋醅中，但其含量很低，仅0.08%。酸类物质大多具有较为强烈的刺激性口感，山楂果醋中酸类物质的种类及其含量，对产品香味的贡献程度远不如其对果醋口感的影响大。

醋醅发酵的山楂果醋样本中共检测到11 种醇类化合物，分别是乙醇、异戊醇、1-戊醇、丝氨醇、桉叶油醇、芳樟醇、苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-3-环己烯-1-醇、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、松油醇。乙醇在3种山楂果醋样本中的相对含量均为最高，其次是异戊醇。乙醇是山楂汁经酒精发酵产生的主要醇类化合物，作为醋酸发酵过程中的底物，发酵结束后有一定的残留。此外，芳樟醇具有铃兰香气；苯乙醇是一种芳香烃的衍生物，具有清甜的玫瑰花香、新鲜面包香味；松油醇具有紫丁香味道，与乙醇一样，同时也存在于山楂汁中。醇类物质主要是在酒化阶段经酵母菌代谢产生或在蛋白质水解过程中由氨基酸脱羧形成的，在山楂果醋的挥发性成分中占16%～19%左右。醇类物质的存在主要是增加果醋圆润的口感，而在香气特征方面的贡献较酯类物质要小。

丰富多样的酯类物质赋予果醋果香或花香的感官特性，是评价果醋品质的一个重要指标。固态醋醅发酵的山楂果醋共鉴定出12种酯类化合物，是3种发酵果醋中酯类物质种类最多的一种。乙酸乙酯的相对含量最高，具有很强的酯香和果香，对山楂果醋的特征香气具有较大的贡献；乳酸乙酯和苯甲酸乙酯的相对含量仅次于乙酸乙酯。此外，苯甲酸乙酯有强的冬青油和水果香气，可用于食用香精中；乙酸异戊酯具有较强的类似苹果的香味；乙酸苯乙酯可用于配制玫瑰香精；辛酸乙酯具有白兰地香型香气，用于配制食用香精。混菌发酵和醋醅发酵的样品中，酯类在挥发性物质中的相对含量均为最高，且其本身属于挥发性强、气味强烈的物质，因此酯类物质很有可能是构成果醋香气特征风味的主导成分。

通过SPME-GC-MS分析，其原因很可能与醋化过程中形成的产物种类与相对含量的不同有关，某些组分通常具有独特的香味或能够辅助其他物质发挥出香气，从而影响了最终产品在风味品质上的差别。除酸类、酯类、醇类这些主要化合物外，山楂果醋中还含有一些酚类、醛类、酮类等物质，如3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)最初形成于醋化阶段，是四甲基吡嗪(川芎嗪)的前体物质；苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香，可用于香料合成；壬醛具有玫瑰花香；丁香酚具有降血压、防腐杀菌的功效，可以延长山楂醋的保质期；同时茶香螺烷、丁香酚、1,4-桉叶素等成分都可以当食用香料使用。虽然这些物质相对含量较低，却极具香气特征，在一定程度上增加或赋予了山楂果醋的水果或花香味。

2.5 不同发酵方式对山楂果醋中总黄酮含量的影响

由表2可知，30 ℃摇床发酵条件下的发酵液，总黄酮的含量总体大于其他两种发酵条件下的发酵液，接种醋醅样品中的总黄酮含量最高，达0.823 mg/mL；其次为混菌发酵的样品，为0.705 mg/mL。

表2 醋酸发酵结束时总黄酮的含量Table 2 The content of total flavonoids at the end of acetic acid fermentation

3 讨论

AS1.41为恶臭醋杆菌，生成醋酸的最适温度为28～33 ℃，最高产醋酸量为6%～9%，因其能氧化分解醋酸为CO2和H2O[18-20]，所以醋化结束后要及时终止发酵，否则容易发生过氧化作用，导致成品醋的总酸含量降低。巴氏醋酸杆菌由于醋酸和酯类的转化率高，所以制得的果醋在感官上要好于采用恶臭醋杆菌发酵的果醋。接种巴氏醋杆菌和戊糖片球菌或醋醅，经发酵制取的山楂果醋无论是理化测定结果，还是物质利用率、产物生成量或种类，相比纯菌种发酵都有明显提高，丰富了山楂果醋的风味。

不同菌种发酵的果醋样本在感官品质上的差异主要体现在果醋的香气和口感上[21]，本试验接种不同菌种发酵的山楂果醋在风味品质方面也有较明显的区别，与韩瑨烜的试验结果相一致。3种山楂果醋样本经检测后发现，纯菌株发酵液中含量最高的是酸类物质，其次是酯类和醇类物质；混菌发酵、接种醋醅的样品中酯类物质的含量最高，酸类物质含量次之，之后是醇类物质。初步确定酸类化合物、醇类化合物、酯类化合物和醛类化合物相对含量较高，是构成山楂果醋香气的主体成分。

乳酸菌对葡萄糖等碳源进行同型发酵和异型发酵时，除了产生大量的乳酸、乙酸外，还产生少量的甲酸、丙酸等其他酸性末端产物。酒化阶段，乙醇假丝酵母的加入在一定程度上会促进乳酸菌的增殖[22]。乳酸乙酯具有天然的芳香气味，对乙酸等刺激性酸味能起到很好的遮味效果，使山楂果醋成品的香味更加柔和。乳酸乙酯的产生是由多种微生物共同作用的结果，先由乳酸菌代谢产生的乳酸和酵母菌代谢产生的乙醇来提供酯化的前体物质，然后在丁酸菌等微生物提供的酯化酶作用下酯化生成。接种混菌和醋醅发酵的山楂果醋中，乳酸乙酯的含量要明显高于纯菌种发酵的样本。山楂中含有丰富的原花青素，特别是低聚原花青素(OPCs)，它们作为主要的酚类化合物，多为表儿茶素，还有少量的儿茶素[23]。研究表明，当在酸性条件下加热时，原花青素会在分子花青素和分子表淀粉中发生水解，导致样品颜色变深。而本试验选择生料发酵法，制成的山楂醋色泽鲜艳，有效减缓了原花青素的降解。

与鲜山楂果肉中的挥发性成分相比[24]，经发酵制得的山楂果醋中仍保留的成分有辛酸乙酯、α-松油醇、苯乙醇、苯甲醛和丁香酚，且这些物质经发酵后各物质含量比鲜果肉中的增加了1.24～18.4倍不等，其中苯乙醇由原来的0.05%增加到0.97%，是增幅最大的物质。一般的发酵产品经过微生物的长期发酵之后都会产生许多不同的副产物，山楂的品种、微生物种类及发酵方式的不同，也会引起最终山楂果醋的挥发性组成成分的差别。本试验酿制的山楂果醋与郝红梅密封发酵90 d所得的山楂醋对比发现，二者的挥发性组分不尽相同，例如：5-氨基颉草酸、正戊酸、芳樟醇、月桂酸乙酯等；但是以山楂为原料酿制的果醋所含酯类物质的相对含量均较高(30%～40%)，这可能是由于新鲜山楂果肉的酯类种类丰富且相对含量高(78.41%)的物种特性所致。

4 结论

综上所述，从山西老陈醋分离得到的优势菌株可以适应山楂果醋的酿制，且由戊糖片球菌和巴氏醋杆菌组成的混菌发酵优于纯菌种(中科AS1.41)发酵，其最佳发酵条件为：酒化的发酵条件为接种安琪果酒专用酵母和乙醇假丝酵母，发酵温度25 ℃，前2 d敞口发酵，后13 d封口发酵；醋化的发酵条件为接种醋醅，接种量为10%(m/m)，发酵温度为30 ℃，发酵时间为6 d，摇床转速为150 r/min，酸度达到6 g/dL，黄酮含量为0.823 mg/mL。

利用SPME-GC-MS技术对不同菌种发酵的山楂果醋香气成分进行了鉴定，酸类、酯类、醇类、醛类和酚类化合物，总含量占总挥发性物质的90%左右，其中乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸、己酸、糠醛、苯甲醛、丁香酚等为香气的主体成分。山楂果醋成品澄清透亮，酸味柔和，略带甜味，保留了山楂果的清香和黄酮、丁香酚、松油醇等功能因子；山楂醋主体自然呈现的棕红色泽，不需要额外添加人工色素，会受到越来越多消费者的偏爱。