响应面法优化纳豆芽孢杆菌富硒的发酵条件

纪雅飞，熊琦

(山西大学 生命科学学院，太原 030006)

纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)，属于枯草芽孢杆菌的一个亚种，是一种可食用益生菌，对人体无病原性[1]。由该菌分泌的糖化酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能将碳水化合物、蛋白质、脂肪等大分子物质分解成低聚糖、小肽、氨基酸、有机酸等易被人体吸收的成分，从而提高营养的利用率[2-3]。该菌能够在酸性胃环境中保持高度的稳定性[4]，且它的代谢产物具有溶栓[5-6]、抗肿瘤、降低血压、抗氧化[7]、维持肠道微生态环境平衡的功能[8]。其发酵食品纳豆现也成为心血管疾病高发区人群的首选健康食品[9]。

硒被认为是地壳中常见的微量元素，在人体维持正常的生理代谢和健康水平中起到重要作用。但土壤中的硒缺乏是一个世界性的问题[10]，适当补硒可促进肠胃吸收功能，调节免疫功能，降低血液中有毒物质含量如重金属铜、镉、铅化合物等[11]。在各种形式的硒化合物中，有机硒比无机硒的毒性低且生物利用率高[12-13]，但人工合成有机硒难度较大，成本较高，因此采用生物法制备有机硒成为研究热点。

本研究通过单因素实验和响应面法优化纳豆芽孢杆菌富硒的发酵条件，对样品进行透析及消化处理，并采用流动注射氢化物-火焰原子吸收光谱法测定有机硒含量[14]，确定最佳有机硒转化率。纳豆芽孢杆菌为可食用益生菌，其对无机硒进行生物转化获得的有机硒可省去提取步骤，且该菌的转化速率较快，降低了制备成本，在为富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌：山西大学生命科学学院光合细菌实验室；水中硒标准溶液(5%硝酸)：北京坛墨质检科技有限公司；硝酸：天津市耀华化学试剂有限责任公司；高氯酸：天津政成化学制品有限公司；硼氢化钾、亚硒酸钠、亚甲基蓝：天津市风船化学试剂科技有限公司；L-半胱氨酸：北京奥博拓达科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

TU-1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；恒温摇床、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AR1140电子分析天平 美国Ohaus公司；数显恒温水浴锅 上海科析实验仪器厂；85-2型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；LH-2A型氢化物发生器 北京有色金属研究总院；A6300火焰原子吸收分光光度计 日本岛津(香港)有限公司。

1.2 培养基的配制

牛肉膏蛋白胨培养基：2%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.5%氯化钠、0.05%牛肉膏，pH值7.0～7.2，在115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化与培养

将4 ℃条件下保存的纳豆芽孢杆菌以5%的接种量接入培养基中，在37 ℃、150 r/min培养12 h，活化3次备用。

1.3.2 生长曲线的测定

将活化好的纳豆芽孢杆菌以5%的接种量接入60 mL培养基中，在37 ℃、150 r/min恒温培养，每2 h取样一次测定OD600 nm值。

1.3.3 样品处理及测定

1.3.3.1 透析样品

使用分子量14000的透析袋于超纯水中透析样品，滴加质量浓度为150 g/L的半胱氨酸溶液2～3滴，期间不断更换超纯水，加入适量亚甲基蓝溶液，若亚甲基蓝保持1 min以上不褪色，则无机硒已被全部析出。

1.3.3.2 消化样品

取1 mL透析后的样品加入烧杯中，添加10 mL混酸(硝酸∶高氯酸为4∶1)，放入2～3个玻璃珠冷消化过夜。次日置于电热板加热赶酸，待样品剩余1 mL时冷却并加入8 mL超纯水，重复操作直至无可见白眼冒出，添加1∶1盐酸8 mL沸水浴10 min，用10%盐酸定容至25 mL容量瓶中待测。

1.3.3.3 标曲的制作

取0.5 mL硒标准储备液于100 mL容量瓶中，用超纯水定容获得硒中间液，取5 mL硒中间液于100 mL容量瓶中，用超纯水定容获得硒标准液，分别吸取0，0.5，1，2，3，4，5 mL硒标准溶液于25 mL容量瓶中，加2.5 mL浓盐酸，用超纯水定容获得质量浓度梯度为0，5，10，20，30，40，50 μg/L的标准溶液，测定硒含量并绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.0047305X-0.00090495，R2=0.9995。

1.3.3.4 有机硒的测定

配制硼氢化钾与氢氧化钠混合溶液：将2 g硼氢化钾、0.2 g氢氧化钠置于100 mL容量瓶中定容，以氮气为载气，10%盐酸为载流液，测定波长196 nm，乙炔点火测定标曲及样品硒含量。代入公式(1)计算有机硒转化率：

公式(1)

式中：N为稀释倍数；ρ1为所测有机硒质量浓度，μg/L；ρ2为添加亚硒酸钠质量浓度，μg/mL；M1为亚硒酸钠相对分子质量；M2为硒相对分子质量。

1.3.4 单因素实验

将纳豆芽孢杆菌作为实验用菌，以亚硒酸钠为无机硒源，以有机硒转化率为最终考核指标,亚硒酸钠与菌株同时添加，亚硒酸钠添加量60 μg/mL、培养基初始pH值7、培养时间48 h、接种量5%为初始条件，在其他因素不变的条件下，分别考察单因素:亚硒酸钠添加时间(亚硒酸钠与菌株同时添加，培养8，16 h)、亚硒酸钠添加量(10，30，60，90，120 μg/mL)、培养基初始pH值(5，6，7，8，9)、培养时间(3，6，12，24，48 h)及接种量(1%、3%、5%、7%、9%)对有机硒转化率的影响。

1.3.5 响应面实验

通过分析单因素实验结果进一步确定各因素对有机硒转化率的影响规律，确定接入菌体同时添加亚硒酸钠，亚硒酸钠添加量10 μg/mL为最佳条件，选取培养基初始pH值、接种量及培养时间作为因变量，有机硒转化率作为响应值，设计三因素三水平的响应面实验，响应面实验因素与水平见表1。

表1 纳豆芽孢杆菌富硒培养参数的响应面因素与水平Table 1 The response surface factors and levels of selenium-rich culture parameters of Bacillus natto

1.4 数据处理

实验重复3次，采用Design Expert 8.0.5软件进行响应面实验设计、方差分析及回归分析；采用SPSS 18.0软件进行单因素实验方差分析；采用Origin 8.5软件制图。

2 结果与分析

2.1 纳豆芽孢杆菌生长曲线

由图1可知，该菌株接种后几乎没有出现延滞期，因为新的培养环境与原有环境基本一致，纳豆芽孢杆菌很快适应了新环境并呈指数增长。菌体生长0～14 h纳豆芽孢杆菌生长力旺盛，为对数生长期。培养12 h后逐渐进入稳定期。菌体生长18 h后进入衰亡期。本实验选取培养0(即亚硒酸钠与菌株同时接入培养基)，8，16 h时加入亚硒酸钠。

图1 纳豆芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Bacillus natto growth curve

2.2 单因素实验

2.2.1 亚硒酸钠添加时间对有机硒转化率的影响

图2 亚硒酸钠添加时间对转化率的影响Fig.2 Effect of sodium selenite adding time on the conversion rate

由图2可知，纳豆芽孢杆菌与亚硒酸钠同时加入培养基时有机硒转化率最高，这与孙博等[15]的研究结果相同，亚硒酸钠能够抑制菌体生长，不宜过早添加，所以在对数生长初期添加亚硒酸钠，此时菌体生长代谢旺盛，有机硒转化率最高，考虑到该菌能够快速适应新的培养环境，即选取亚硒酸钠与菌体同时接入培养基为最适亚硒酸钠添加时间。

2.2.2 亚硒酸钠添加量对有机硒转化率的影响

图3 亚硒酸钠添加量对转化率的影响Fig.3 Effect of the additive amount of sodium selenite on the conversion rate

由图3可知，有机硒转化率随着亚硒酸钠添加量的升高而降低，细菌将亚硒酸钠转化为有机硒的过程是其在受到亚硒酸钠的毒性作用胁迫后的一种自我保护行为，亚硒酸钠浓度越高，对纳豆芽孢杆的毒性作用越大，菌体生长受到抑制[16]，所以该菌在高浓度亚硒酸钠环境中有机硒转化率较低，因此选择10 μg/mL为最适亚硒酸钠添加量。

2.2.3 培养基初始pH值对有机硒转化率的影响

图4 培养基初始pH值对转化率的影响Fig.4 Effect of initial pH value of culture medium on the conversion rate

由图4可知，有机硒转化率随着培养基初始pH值的增大呈现先升高后降低的趋势，pH值为7时转化率最佳。pH对菌体膜渗透性、细胞膜电荷及营养物质离子化程度具有影响作用，从而对其营养的吸收及生长产生影响[17-18]，过酸过碱都不利于纳豆芽孢杆菌吸收营养及生长，使有机硒转化率降低，因此选择pH值为7作为最适培养基初始pH值。

2.2.4 培养时间对有机硒转化率的影响

图5 培养时间对转化率的影响Fig.5 Effect of culture time on the conversion rate

由图5可知，培养3～6 h有机硒转化率显著升高，结合生长曲线，此时菌体进入新环境，生长旺盛，有机硒转化率升高较明显。培养6～12 h转化率虽有提升但不显著，此时菌体的生长状况较前6 h有下降趋势，加之亚硒酸钠对菌体生长具有抑制作用，所以有机硒转化率升高不明显。培养12 h后转化率趋于稳定，菌体生长12 h后逐渐进入稳定期，所以有机硒转化率逐渐趋于平稳，这与靳志强等[19]的研究结果相似。所以选择6 h为最适培养时间。

2.2.5 接种量对有机硒转化率的影响

图6 接种量对转化率的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on the conversion rate

由图6可知，接种量为3%时转化率达到最高，随着接种量的增大或减小，转化率有所降低，接种量为9%时转化率有升高的趋势但并不显著。因为接种量对菌种的生长有一定的影响，接种量过小时，导致菌体细胞内的某些维生素和辅基发生扩散，不利于菌种生长；接种量过大时，加快了菌体对培养基的消耗，也不利于菌种的生长[20]。所以选择3%为最适接种量。

2.3 响应面实验

2.3.1 实验结果及回归分析

以取得有机硒最高转化率为目的，根据单因素实验结果，选择培养基初始pH值(A)、接种量(B)、培养时间(C)作为因变量，有机硒转化率(Y)作为响应值，设计三因素三水平的响应面实验，实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及转化率Table 2 RSM design and conversion rate

表3 有机硒转化率回归模型及显著性分析Table 3 Organic selenium conversion rate regression model and significance analysis

续 表

由表3可得回归方程为：Y=88.43+6.90A+7.00B+6.01C+6.65AB+0.54AC+4.59BC-9.88A2-23.96B2-6.03C2。

此模型F=17.59，P<0.01，差异极显著，表明本次模型建立有意义；R2=0.9577，表明回归方程拟合度良好，实验方法可靠，能够对实验数据进行分析及预测；失拟项F=4.06，P>0.05，无显著性差异，说明实验结果中非正常误差较小，可由此模型得到有机硒最佳转化率。结果表明，本实验因素培养基初始pH值(A)、接种量(B)、培养时间(C)对有机硒转化率的主次影响顺序：B>A>C。一次项A、B和二次项A2、B2对响应值影响极显著，一次项C和交互项AB对响应值影响显著，其余项对响应值影响不显著。

2.3.2 实验因素交互作用分析

各因素交互作用的响应面图及等高线图见图7～图9，均采用Design Expert 8.0.5软件进行绘制。

图7 培养基初始pH值与接种量对转化率影响的响应面图及等高线Fig.7 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and inoculation amount on conversion rate

图8 培养基初始pH值与培养时间对转化率影响的响应面图及等高线Fig.8 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and culture time on conversion rate

图9 接种量与培养时间对转化率影响的响应面图及等高线Fig.9 Response surface plot and contour of inoculation amount and culture time on conversion rate

响应面法是通过分析自变量之间的相互作用以及自变量对响应值影响优化工艺的方法，是一种用于食品加工中高产和产品质量验收的技术[21]。本研究通过Design Expert 8.0.5软件对表2实验设计所得结果进行分析并绘制各实验因素间交互作用的响应面图及等高线图，等高线的椭圆程度表示两因素交互作用对响应值影响的显著性，椭圆程度越大表示影响越显著[22]。响应面的坡度表示实验因素对有机硒转化率的影响大小，坡度越大表示影响越大。

由图7可知，接种量1%～5%、培养基初始pH值在6～8范围内，有机硒转化率先升高后降低。接种量3%、pH 7.0附近值对有机硒转化率的影响较重要。接种量响应面坡度较大，表明接种量对有机硒转化率影响较大。等高线椭圆程度大，表明培养基初始pH值与接种量的交互作用明显。由图8可知，响应面整体坡度小，随着培养时间的延长，有机硒转化率呈现不显著的升高趋势，培养基初始pH值在6～8范围内，有机硒转化率先升高后降低。等高线椭圆程度小，表明培养基初始pH值与培养时间的交互作用不明显，结果与显著性分析一致。由图9可知，随着培养时间的延长，有机硒转化率有不显著的升高趋势；随着接种量的增大，有机硒转化率呈现先降低后升高的趋势且响应面坡度较大，结合图7中结果表明接种量是影响纳豆芽孢杆菌有机硒转化率的重要条件。

2.3.3 最优转化率实验条件的确定及验证

通过Design Expert 8.0.5软件分析获得最优发酵条件为：培养基初始pH值7.46，接种量3.54%，培养时间10.30 h，转化率理论值为92.8194%。考虑到实际操作的难易程度，将培养基初始pH值改为7.5，接种量改为3.5%，培养时间改为10 h。根据上述实验条件进行3次验证实验，所得有机硒转化率为91.21%，实验结果与预测值无显著性差异，表明通过响应面法优化所得的纳豆芽孢杆菌富硒培养参数具备可靠性和可操作性。

3 结论

本研究通过响应面法优化了纳豆芽孢杆菌富硒的发酵条件，最终确定的优化条件为：接入菌体时添加亚硒酸钠，接种量为3.5%，亚硒酸钠质量浓度为10 μg/mL，培养基初始pH值为7.5，培养时间为10 h。通过以上条件所得有机硒转化率为91.21%。此次研究在为富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的参考价值，且纳豆芽孢杆菌对无机硒进行生物转化获得的有机硒可省去提取步骤，转化速率较快，降低了制备成本，具有良好的应用前景。