油橄榄果渣中多酚提取及活性研究进展

王安华，龙国清，王东东，於洪建，贾景明*

（1.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016；2.天津益倍生物科技集团有限公司，天津300457）

油橄榄（Olea europaea L.）为木犀科木犀榄属油料作物，是世界著名的亚热带果树和重要经济林木，其果含有丰富的优质油橄榄油，具有极高的食用和药用价值[1]。全世界亚热带地区均有引种栽培，以希腊、意大利、西班牙、土耳其、叙利亚等地中海地区最为盛行[2]。早在9 世纪，我国就有少量油橄榄零星种植，当时称之为“齐墩果”，后在20 世纪60 年代初期，我国甘肃、四川、广东、云南等地逐渐开始引种，并将“齐墩果”改名“油橄榄”[3]。油橄榄的生长和挂果对于土壤酸碱性、光照和环境湿度等气候条件要求很高，北纬33°纬度带被誉为“油橄榄的黄金生长带”。我国甘肃省陇南市白龙江流域恰好处于最适合种植油橄榄的区域，在当地具有我国最大的油橄榄种植基地，其油橄榄种植面积与橄榄油产量都居于全国首位[4-5]。油橄榄全身都是宝，油橄榄果、橄榄油和油橄榄叶都有着非常丰富的利用价值[6]，甚至在榨油产生的果渣以及废水中也都含有丰富的多酚类成分，如橄榄苦苷、羟基酪醇及酪醇等[7-8]。现代药理学研究发现，油橄榄多酚具有抗氧化[9]、抗肿瘤[10]、抗炎[11]、抗菌[12]、抗病毒[13]、抗衰老[14]、抗高血压[15]和降血糖[16]等多种药理活性，可应用于药品、化妆品、保健食品和功能性食品。目前，油橄榄果实在榨取橄榄之后，其榨油果渣大量堆积，一直没有一条合适的途径用于橄榄果渣的合理利用，造成严重的资源浪费和环境污染。因此，本文基于油橄榄多酚的重要价值，对油橄榄果渣中多酚的提取工艺及其生物活性展开综述，旨在为油橄榄果渣废弃物的回收利用及相关产品的开发提供理论基础。

1 油橄榄果渣中多酚的提取

目前油橄榄果渣中多酚提取方法有加热回流提取法、溶剂萃取法、多种辅助提取法、超临界流体萃取法及联合提取法等。

1.1 加热回流提取法

加热回流提取法是最常见的一种提取方法。该方法主要通过持续不断地加热，使细胞因吸溶剂膨胀破裂，从而使得多酚从细胞内扩散到细胞外再扩散到外部溶剂中。其优点是设备简单、工艺操作简单、成本低等，广泛应用于工业化生产。但也存在提取时间长等缺点，还有待改善。

谢碧秀等[17]以丙酮为溶剂，采用加热回流提取法提取油橄榄果渣，通过正交设计得到了最优提取工艺，即75%的丙酮，温度为60 ℃，料液比为1 ∶13（g/mL），浸提时间为4h，优选工艺提取的多酚含量为0.2448%。IOANNIS 等[18]以无毒环保的甘油-水为提取溶剂，以2-羟丙基-β-环糊精作为增强剂（形成水溶性包合物提高橄榄多酚的可提取性），通过响应曲面法确定最优条件，即甘油浓度60%（质量体积比），环糊精浓度为7%（质量体积比），提取温度为60 ℃，该工艺条件下所得多酚含量提取率为54.33 mg GAE/g dw（GAE 为没食子酸当量；dw 表示油橄榄叶干重）。RIOS 等[19]将橄榄果渣先冻干，然后用乙醇-水低温提取，最佳的乙醇和水的体积比为80 ∶20，最佳温度为0 ℃～4 ℃。低温大大减少了橄榄苦苷的水解，减少了30%的溶剂，缩短了33%的提取时间。

1.2 萃取法

萃取法操作简单方便，多用于样品的分离与提纯，重现性也较高，但是该方法所需要的萃取溶剂较多且萃取时间一般较长。裴梦雪等[20]利用液液萃取法，以乙醇、甲醇、丙酮和水为萃取溶剂，研究了橄榄油中总多酚的提取工艺。最后研究发现，甲醇/水和丙酮/水的萃取效果最好，明显优于乙醇/水，但考虑到丙酮易挥发且与橄榄油完全互溶，又有较大毒性的特点，最后选择甲醇/水为主要萃取溶剂，得到了最佳的提取工艺：60%的甲醇为萃取溶剂，时间为60 min，提取3 次，料液比为1 ∶2（g/mL），在该条件下，所得油橄榄多酚提取率为11.16 mg/kg。

ROMERO 等[21]利用溶剂萃取法，以乙酸乙酯和正丁醇为萃取溶剂，对油橄榄果渣中橄榄苦苷、羟基酪醇和对羟基苯乙醇3 种多酚类化合物进行了研究。最终得到最佳萃取条件为乙酸乙酯∶正丁醇∶果渣废液的体积比为1 ∶1 ∶1，此时得到羟基酪醇、对羟基苯乙醇和橄榄苦苷的提取率分别为92%、96%、83%。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取技术就是利用微波加热的特性来对原材料中的有效成分进行选择性提取的方法，通过调节微波加热产生的振动作用，加速细胞内有效成分的释放、扩散及快速溶解于提取溶剂，从而提高了有效成分的提取效率。该方法操作简单、所需时间较短、且所需提取溶剂用量少，最近几年在功能成分的提取方面运用较为广泛。

舒适等[22]利用微波辅助技术，以乙醇为提取溶剂，对油橄榄果渣的多酚成分进行了提取，最后通过单因素和正交试验，优化得到了油橄榄多酚最佳提取工艺：50%乙醇为提取溶剂、微波功率200 W、微波时间2 min、料液比为1 ∶20（g/mL）。在该提取条件下，油橄榄果渣中多酚的得率为0.97%。而孔维宝等[23]也采用乙醇为提取溶剂，运用微波辅助法提取了油橄榄果渣中的多酚类成分，得到的最佳提取条件与舒适等研究相似，且在该提取条件下，油橄榄果渣多酚含量可达1.02%，这样的提取量比常规溶剂提取法提高了近40%。SELIN 等[24]利用微波辅助提取了橄榄果渣中总多酚和橄榄苦苷，通过响应曲面优化，得到的最佳工艺条件为微波功率250 W，提取时间2 min，在此工艺条件下总多酚的产率为2.48%，橄榄苦苷的产率为0.06%。

另外，JURMANOVIC 等[25]研究发现，将提取环境改为密闭容器系统中，以20%乙醇为萃取溶剂，微波施加700 W 的功率保持10 min，可得到羟基酪醇的收率为1.216 mg/500 g。王寒冬等[26]又将提取材料从果渣改为新鲜的油橄榄鲜果，得出了油橄榄多酚的最佳提取工艺条件为：微波功率490 W、微波时间48 s、料液比1 ∶23（g/mL），最终油橄榄多酚实际平均得率达到了6.965 9 mg/g。

1.4 超声辅助提取

超声辅助提取法是超声技术在食品工业中的重要应用之一，即利用超声波的特性，促使原材料组织、细胞破裂或变形，迫使有效成分溶出的一种提取方法。该方法提取效率较高，且由于不需要加热，也适用于易挥发或易高温降解的有效成分的提取。

宋照风等[27]以单因素试验为基础，进行二次正交旋转试验设计，优化得到了油橄榄多酚最佳提取条件，即提取溶剂为43%乙醇，超声时间37 min、水浴温度46 ℃、料液比为1 ∶32（g/mL），最终得到的油橄榄多酚提取率为14%。MOJERLOU 等[28]利用超声辅助提取油橄榄多酚，通过响应面法优化得到最佳的提取条件为：超声功率200 W，温度56 ℃，超声时间3 min，测定总酚类化合物含量为4.04 mg/g。

PETRA 等[29]建立了以60%乙醇为提取溶剂，超声功率为400 W，温度为70 ℃，超声时间为120 min，同时加入环糊精作为提取增强剂，按1 ∶40（g/mL）料液比提取油橄榄果渣中多酚类成分，最终得到的提取物中橄榄苦苷、羟基酪醇和酪氨酸的含量分别为1 744、887、1 117 mg/kg。

1.5 酶解辅助提取法

目前酶解辅助提取法在酚类化合物的提取方面应用较少，有着极大的潜在开发价值。SOFIA 等[30]研究了酶解辅助法提取油橄榄多酚的工艺条件。以果胶酶和聚半乳糖醛酸酶联合提取多酚的最佳工艺为：pH 值4.5，反应时间1 h，反应温度40 ℃，料液比1 ∶12.5（g/mL），该方法最终得到总多酚的收率为8.42 mg/g。

1.6 其它提取方法

关于油橄榄多酚提取的研究，除上述方法以外，还有超临界提取法，多项提取方式并用的联合提取技术也用于油橄榄多酚的提取工艺研究。Ashley 等[31]采用超临界流体萃取技术对油橄榄果渣进行了多酚提取研究，同时以DPPH 自由基清除能力为重要指标，确定了最佳提取条件，即60%乙醇为助溶剂，30 MPa 为的最佳压力，温度为50 ℃，时间为60 min。在该条件下，所得油橄榄多酚中羟基酪醇含量达到了1.25 mg/g，抗氧活性结果中EC50达到85.33 μg/mL，比常规的溶剂提取法所得多酚的抗氧化活性提高了23.33%。

项昭保等[32]采用超声-微波协同提取的方法提取橄榄多酚。在单因素试验的基础上，采用响应面法优化超声-微波协同提取橄榄多酚的提取工艺。得到最佳提取工艺为：微波功率550 W，微波时间4.4 min，超声功率330 W，乙醇浓度62%，得率为6.33%。

2 油橄榄果渣中多酚的生物活性

油橄榄果渣中富含橄榄苦苷、羟基酪醇、咖啡酸等多种酚类化合物，具有广泛的药理活性。现代药理研究表明，油橄榄中的多酚类物质具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗炎等生物活性。

2.1 抗氧化作用

油橄榄果渣中多酚对超氧阴离子自由基、亚硝酸盐等表现出良好的清除能力，间接反映了油橄榄多酚的体外抗氧化能力，当油橄榄果渣多酚提取物浓度为0.5 mg/mL 时，对亚硝酸盐、超氧阴离子自由基的清除率分别达到52.27%、63.64%[17]。Masoud 等[33]还在体内水平探讨了油橄榄多酚提取物作为天然抗氧化剂对无水乙醇诱导的肠黏膜损伤的抗氧化作用，结果显示，油橄榄多酚治疗组小鼠的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著升高；同时，相比于乙醇组对照组，多酚治疗组小鼠的十二指肠绒毛受损明显减轻或消失，黏膜层凝固性坏死减少，这都表明油橄榄多酚提取物具有显著的抗氧化作用。此外，Alessandra 等[34]采用DPPH 法和ABTS 法测定油橄榄果渣提取物的总酚含量和抗氧化活性，试验结果显示，得出油橄榄80%乙醇提取物具有良好的抗氧化活性，抗氧化能力明显优于纯乙醇提取物，并提出该提取物可以作为食品工业中合成抗氧化剂的合适替代品，以提高食品质量。

而橄榄苦苷作为油橄榄多酚的特征性成分，多年来也受到诸多学者的关注。吲哚美辛是常见的甾体类抗炎药，长期使用会导致胃溃疡，因此Yavas 等[35]研究了以吲哚美辛诱导的大鼠产生胃溃疡，然后灌胃给药橄榄苦苷，考察橄榄苦苷对吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡的抗氧化作用，结果显示，当橄榄苦苷浓度达到18 mg/kg时，可见大鼠体内丙二醛和髓过氧化物酶的活性显著降低，同时提高了大鼠组织中抗氧化酶的活性，这表明橄榄苦苷可能对吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡和氧化应激有保护作用，表现出明显的抗氧化特性。

2.2 抗肿瘤作用

关于油橄榄多酚类成分抗肿瘤活性的研究，主要集中在橄榄苦苷和羟基酪醇抑制多种肿瘤的生长、增殖、侵袭迁移、促进凋亡等方面。Yamada 等[36]用橄榄苦苷和羟基酪醇研究对人体肝癌细胞迁移的影响，研究结果表明，橄榄苦苷和羟基酪醇能够明显抑制TGF-α诱导的HuH7 细胞迁移，并呈现一定的剂量依赖性，同时机制研究显示，它们能够通过抑制肝癌细胞中p38 MAPK 和ρ 激酶途径，达到抑制肝癌细胞迁移的作用。Mao 等[37]研究发现，橄榄苦苷可抑制人肺癌A549 细胞的增殖和迁移，并能诱导细胞内活性氧和甲烷二羧酸醛水平的浓度依赖性下降。Bhardwaj 等[38]使用雄激素依赖和雄激素不依赖（C4-2）的人类PCa 细胞系以及正常/良性（RWPE1 和RWPE2）前列腺上皮细胞系进行功能和生化检测，以研究羟基酪醇对PCa 的生长抑制活性，结果观察到羟基酪醇对这两种前列腺癌细胞系均呈现剂量依赖性和时间依赖性抑制作用，而对正常人类前列腺上皮细胞无明显作用；Annexin-V 染色，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]裂解等试验也证明经羟基酪醇处理的LNCaP和C4-2 发生了明显了细胞凋亡，同时，经羟基酪醇处理的PCa 细胞通过细胞外基质迁移和入侵的能力显著下降；免疫印迹分析显示，在羟基酪醇处理的PCa细胞中，Akt 和STAT3 的磷酸化水平降低，表明它们的活化程度降低。综上，Bhardwaj 等提出，羟基酪醇可作为预防和治疗前列腺癌的一种新的营养药物。此外，Mansouri 等[39]还研究了橄榄苦苷针对乳腺癌中组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的表达影响，发现橄榄苦苷明显降低MCF-7 细胞的侵袭和细胞活力，同时诱导MCF-7 细胞凋亡，并通过定量逆转录聚合酶链反应检测发现，经橄榄苦苷作用后乳腺癌细胞中HDAC4 呈剂量依赖性降低，而HDAC1 的表达未见明显变化，即橄榄苦苷可能通过调节MCF-7 细胞中重要的表观遗传因子HDAC4 诱导细胞凋亡，从而抑制细胞的增殖和侵袭，因此他们提出橄榄苦苷有可能成为预防和治疗乳腺癌的新药物。

2.3 抗炎作用

Chaoran 等[40]研究了油橄榄甲醇提取物（O.europaea L. methanol extract，OeME）和乙醇提取物（O. europaea L.ethanol extract，Ohee）对巨噬细胞RAW264.7 中炎症介质NO 和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的产生、促炎基因表达水平和细胞内炎症信号活性的影响，结果显示，OeME 和Ohee 均能够抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、Pam3CSK4 和poly （I：C）诱导的RAW264.7 细胞中NO 和PGE2 的产生，且二者均未表现出细胞毒性；OeME 和Ohee 还能够下调环氧合酶-2 （COX-2）、iNOS、IL-6、IL-1、TNF-α 的mRNA表达水平，进而发挥抗炎作用。Park 等[41]研究了橄榄苦苷对LPS 诱导的BV-2 小胶质细胞的影响，研究发现，橄榄苦苷能够抑制LPS 诱导的BV-2 细胞中促炎因子如NO 的产生，并抑制ERK/p38/NF-κB 激活和促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成；同时它还可以抑制LPS 诱导的BV-2 细胞线粒体过渡分裂，通过减少Drp1 去磷酸化来调节线粒体ROS 的生成和抑制小胶质细胞的促炎症反应，这些研究表明，橄榄苦苷可能在小胶质细胞炎症介导的神经退行性疾病中发挥重要作用。此外，对于橄榄苦苷的水解苷元，也有抗炎活性方面的相关报道，Daniela 等[42]通过脊髓损伤小鼠模型，考察了橄榄苦苷和其苷元的水解产物对脊髓损伤小鼠的抗炎作用，发现经过橄榄苦苷苷元处理的小鼠体内促炎细胞因子的产生明显减少，如肿瘤坏死因子和一氧化氮合酶，推测橄榄苦苷苷元可能在各种炎症疾病的治疗中发挥作用。

2.4 抗菌作用

Ling 等[43]采用牛津杯碟扩散法研究了油橄榄果渣中14 种酚类化合物的对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑菌活性，包括橄榄苦苷、羟基酪醇、对羟基酪酚、丁香酚、咖啡酸和3，4-二羟基苯甲酸等，结果显示，14 种酚类物质对两种细菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直径在10.2 cm～17.9 cm之间，且对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显优于大肠杆菌；从抑菌圈结果看，抑制效果最好的是羟基酪醇，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（24.8±0.1）mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为（17.9±0.2）mm，橄榄苦苷的作用次之，对两种细菌的抑菌圈直径分别为（20.4±0.1）mm和（14.6±0.1）mm。上述结果表明，羟基酪醇与橄榄苦苷都具有良好的抗菌活性。

此外，吴遵秋等[44]以滤纸片法考察橄榄苦苷对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，研究发现，橄榄苦苷可延缓这3 种细菌的对数生长期，当其浓度达到10 mg/mL 时，对大肠杆菌的抑制效果最为明显，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为0.025 mg/mL，其次为金黄色葡萄球菌，MIC 为0.05 mg/mL，属于高敏感状态，对枯草芽孢杆菌的敏感程度相对较低，MIC 为0.4 mg/mL，表明橄榄苦苷对大肠杆菌等具有显著抗菌作用。

2.5 抗病毒作用

在抗病毒方面，油橄榄也表现出一定的作用。病毒性出血败血症（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）的感染往往是致死性的，流行于欧洲大陆，Micol 等[45]研究发现，橄榄苦苷能抑制VHSV 的体外感染，将橄榄苦苷溶液加于感染该病毒36 h 后的细胞中，可剂量依赖型地大幅度降低病毒丰度和病毒蛋白的积累；同时，橄榄苦苷能够抑制未感染细胞间与感染病毒细胞的膜融合，表明橄榄苦苷能够干扰病毒的融合。Elisa 等[46]发现油橄榄中多酚类化合物羟基酪醇通过参与逆转录酶的合成来抑制HIV-1 病毒的复制，其可以作为一种潜在的消毒剂，用于预防HIV-1 的传播或减少其在女性生殖道中的感染。

2.6 其它作用

Benlarbi 等[47]研究了橄榄苦苷对醛糖还原酶活性的抑制作用。研究结果表明橄榄苦苷对醛糖还原酶有明显的体外抑制作用，在高血糖条件下，研究了橄榄苦苷对人视网膜视杆细胞和视锥细胞的体外保护作用，发现橄榄苦苷通过提高光感受器的生存能力来保护视网膜细胞免受葡萄糖的毒性作用。

Roberto 等[48]研究了特级初榨橄榄油的多酚成分橄榄苦苷对餐后血糖的作用及其机制，研究结果与对照组相比，服用橄榄苦苷的受试者血糖明显降低，二肽基肽酶Ⅳ活性明显降低，胰岛素升高，其作用机制为橄榄苦苷通过阻碍NADPH 氧化酶2 衍生的氧化应激改善餐后血糖水平。

Pantano 等[49]在小鼠饮食中添加与橄榄油厂废水中发现的同等剂量的多酚混合物，发现该多酚对小鼠认知功能具有显著改善作用。Abe 等[50]研究橄榄油中的多酚橄榄苦苷对血管平滑肌细胞增殖的影响，在有橄榄苦苷存在的情况下，细胞增殖抑制率达到92%，机制研究表明，橄榄苦苷通过在G1 期和S 期之间的细胞周期阻滞来抑制平滑肌细胞的增殖，这可能是由于通过ERK1/2 调控的。

3 总结与展望

橄榄油由于具有丰富的营养价值和保健功能而受到人们的广泛青睐，而在生产橄榄油的过程中会产生大量果渣废弃物，其中残留有大量的多酚类物质未被加工利用，这不仅造成资源的浪费，而且引起严重的环境污染。本文以油橄榄果渣为研究对象，综述了几种提取油橄榄多酚的现代工艺研究方法，并系统地总结油橄榄果渣中多酚类成分的现代药理活性。这将对实现橄榄油加工废弃物的综合利用与其活性化合物的综合开发利用提供重要的参考价值，以期为开发油橄榄果渣中多酚类物质相关的产品提供依据。