云南文山市石漠化土壤真菌多样性研究

沈清清，赵 芳，胡 彦，吴风志，胡国贤

（1.文山学院 三七医药学院，云南 文山 663099；2.文山学院 冶金与材料学院，云南 文山 663099）

石漠化是一种严重的地质生态灾害，会导致土地生产力下降、植被退化、当地贫困面扩大等环境问题和社会问题[1]。云南省的石漠化现象在全国范围内属于较为严重的，其中文山州的石漠化程度在云南省较为严重和典型，全州岩溶面积1 352 451.1 hm2，其中47.84 %属于石漠化土地，面积为646 967.7 hm2[2]。

目前我国持续开展了许多植被恢复治理项目[3-5]，获得了系列成功的治理模式和技术，但至今存在生态效应不稳定、治理成效巩固困难的特点[6-7]。因此解决问题的根本在于优化喀斯特石漠化区域环境，提高植物对土壤的适应能力。改善土壤环境，使之利于植物的生长，除需要改良土壤的物理和化学性质外，土壤中的微生物结构与组成是另一关键要素，生态系统的稳定性也与之密切相关。真菌是土壤中的一大类群，无论是在维持植物的生长、发育、抗逆性方面，还是分解土壤中有机质和改良土壤方面都属于主要的功能类群[8-10]。目前国内外对土壤真菌多样性的研究颇多，但对于石漠化土壤中真菌多样性的研究近年来才开始兴起[11-13]，相关报道比较有限。本研究采用第二代Illumina MiSeq 高通量测序技术[14-15]对文山市喀斯特石漠化土壤真菌进行鉴定，分析真菌的多样性信息及分布格局，探明真菌优势菌群，旨在丰富人们对石漠化土壤真菌群落特征的认识，为石漠化区域退化土壤的修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

经野外实地考察，选择文山市3 个典型的喀斯特石漠化样区作为样本（1 号样本、2 号样本和3号样本）采集地点（GPS 定位信息：23°33′99″ N，104°30′44″ E；23°37′6″ N，104°26′62″ E；23°36′74″N，104°21′86″ E），每个样本采集地点随机选择植物生长相对茂盛的3 个样方（样方间距约50 m），按照“五点混合法”和“抖落法”采集植物根际土壤。将采集到的全部土样迅速带回实验室进行处理，剔除植物残根、石粒和其他可能杂物，之后将每个样区里采集的3 个样方土壤各取10 g 充分混匀装入已灭菌采样袋，置于-80 ℃ 超低温冰箱保存。

1.2 土壤DNA提取和PCR扩增

土壤DNA 提取选用QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit 12888-100 试剂盒，按照说明书的相关步骤提取土壤总DNA。

PCR 扩增序列为18S rDNA V4-V5 区；引物为ITS1F 和ITS2R（ 序 列 分 别 为5′-CTTGGTCA TTTAGAGGAAGTAA-3′和 5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′）；扩增条件为预变性（95℃，2 min）、变性（94 ℃，20 s）、退火（55 ℃，40 s）、延伸（72 ℃，1 min，35 个循环）、终延伸（72 ℃, 2 min）。每个样本3 个重复，将同一样本扩增产物进行混合。

1.3 测序数据处理

将样本PCR 产物送上海天昊遗传分析中心构建 Miseq 文库，双向荧光竞争性PCR 定量，毛细管电泳文库检测，文库合格后，采用Illumina Miseq 2X300bp 双向测序, 每个样本不低于50 000 clean reads；使用FLASH 软件对miseq 双末端测序数据合并，利用特异性引物信息去除barcode 序列，处理抽提有效序列，统计长度分布。为了进一步保证序列准确性，过滤后引物超过2 个碱基的错配，丢弃长度短于200 bp 和总碱基错误率高于1 的序列；为减少分析过程的冗余计算，合并重复序列后提取非重复序列，使用软件UPARSE[16]去除其中的Chimeric序列，经以上质控后获得clean reads。根据不低于97%相似性的标准将clean reads 归并到相关OTU 中。

1.4 统计与生物信息学分析

分析并计算不同样本中微生物的多样性评估指数即ace，chao，simpson，shannon，coverage 的值（采用平台：mothur）；将样品序列与silva 数据库中的已知序列进行检索和比对，抽提样品中OTUs 在界、门、纲、目、科、属、种6 个分类阶元上的物种分类信息；采用R语言分析群落组成和结构以及优势菌群。

2 结果与分析

2.1 α多样性

通过计算各样本中α 多样性指数统计量可以获得描述和评价真菌多样性信息。图1 为稀释性曲线，随机抽取的个体和物种数可以说明样本的取样大小是否合理，如图1 所示，1、2 和3 号土壤样本的稀释曲线随着样品序列数的增加均趋于平缓，意味着增加测序数量不会产生新的物种，测序取样数量和深度能合理反映样本土壤真菌群落情况。

图 1 土壤样本中OTU稀释性曲线

3 个典型样本获得的总有效序列条数和经过处理优化后的总序列数分别为 185 511 和 168 677，序列长度的平均值均为 452.7 bp。1 号样本中含 56 234 条序列，去冗余等处理后的序列聚类获得 262 个分类单元（OTU）；2 号样本比1 号样本少5 994 条序列，去冗余等处理后的序列聚类获得 252 个分类单元（OTU）；3 号样本比1 号样品少5 075 条序列，去冗余等处理后的序列聚类获得 253 个分类单元（OTU）。如表1 所示，指示类群丰度的指数Ace 最低值为270.363 147 7±63.625 272 2（平均值±标准差，下同），最高值为273.197 138 0±80.477 988 6，同样指示类群丰度的指数 Chao 最低值为270.889 883±79.831 098 8，最高值为274.598 920 7±46.592 737 7；指示类群多样性的指数 Shannon 最低值为3.008 140 0±0.000 214 8，最高值为3.059 505 0±0.000 194 9，同样指示类群多样性的指数 Simpson 最低值为0.092 392 0±0.000 001 5，最高值为0.101 014 3±0.000 214 8。以上数据均显示3 个样本间的真核微生物丰度与真核微生物群落多样性差异不显著（P＞0.05），表明文山市石漠化土壤中真核微生物的丰度和多样性特征比较均态化。另外，从表1 中还可获得样本所测序列覆盖率的信息，三个样本的Coverage 值均在99%以上，如此之高的覆盖率表明所测结果与土壤样本中真实菌群高度一致，统计学上具有较高的可信度。

表1 不同土壤样本中α 多样性指数分析

2.2 土壤中的真核微生物群落结构

2.2.1 真核微生物群落结构分析

OTUs 与silva 库中的参考序列比对分析后进行分类学鉴定，从6 个分类阶元层面（界、门、纲、目、科、属、种）分析真核微生物的组成及丰度。从3 个样本获得的序列共归入20 门43 纲65 目58 属。从门阶元层上看属于真菌的有7 个门，分别是：子囊菌门（Ascomycota，占总菌群的69.23%～71.07%）、担子菌门（Basidiomycota，占总菌群的7.91%～ 8.61%）、芽枝霉门（Blastocladiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota，占总菌群的7.20%～8.47%）、球囊菌门（Glomeromycota，占总菌群的3.40%～3.59%）、毛霉菌亚门（Zoopagomycotina，占总菌的0.13%～ 0.29%）、接合菌门（Zygomycota，占总菌群的3.65%～4.11%），其中相对丰度最高的是子囊菌门。从纲阶元层上分析子囊菌门门下的座囊菌纲（Dothideomycetes，占总菌群的36.67% ～37.96%）和粪壳菌纲（Sordariomycetes，占总菌群的20.22%～21.50%）丰度占比最高，其余5 个纲所占丰度稍低，为散囊菌纲（Eurotiomycetes，占总菌群的7.64%～8.79%)、壶菌纲（Chytridiomycetes，占总菌群的6.63%～7.64%）、伞菌纲（Agaricomycetes，占总菌群的5.43%～5.83%）、球囊菌纲（Glomeromycetes，占总菌群的3.40%～3.59%）、银耳纲（Tremellomycetes，占总菌群的1.72%～2.39%），以上菌纲总和占比达84.57%～84.79%，其余占比较低，且其中有9.33%～10.39%为没有分类信息或未入库的序列。从目阶元层面上看座囊菌纲下所属的格孢腔目（Platyophryid，占总菌群的20.67%～21.71%）和煤炱目（Capnodiales，占总菌群的14.29%～15.66%），以及粪壳菌纲下所属的肉座菌目（Hypocreales，占总菌群的19.24%～20.38%）属于丰度占比较高的菌目，另外散囊菌纲下所属的刺盾炱目（Chaetothyriales）和散囊菌目（Eurotiales）分别占总菌群的5.35%～6.76%和1.93%～2.16%、壶菌纲下所属的壶菌目（Chytridiales）和小壶菌目（Spizellomycetales）分别占总菌群的3.36%～3.83%和1.08%～1.91%、伞菌纲下所属的鸡油菌目（Cantharellales）和伞菌目（Agaricales）分别占总菌 群 的2.65% ～3.24%和2.53% ～2.87%、 球 囊菌纲下所属的球囊霉目（Glomerales）占总菌群的3.32%～3.48%。从属分类水平上看，不能明确其分类信息和未培养水平的核酸序列达52.70%～53.98%，表明石漠化土壤中存在大量有待挖掘和开发利用的微生物资源。在属阶元层上已确定分类地位的核酸序列中，Boeremia（占总菌群的15.10%～16.88%）和芽枝霉属（Cladosporium，占总菌群的13.25%～14.28%）具有绝对的优势地位，总和最高达31.16%。旋孢腔菌属（Cochliobolus，占总菌群的3.66%～6.12%）、丝核菌属（Rhizoctonia，占总菌群的2.70%～3.24%）、伞菌属（Agaricus，占总菌群的2.53%～2.87%）、球腔菌属（Mycosphaerella，占总菌群的1.04%～1.43%）4 个属相对丰度总和在9.93%～14.42%范围，剩余各属相对丰度均低于1%。

2.2.2 样方土壤中AM真菌分布状况

与AM 真菌权威网站Arthur Schüßler（http://www.amf-phylogeny.com）发布的AM 真菌分类信息比对后，如图2 所示3 个样本土壤中均存在AM 真菌分布，但其类型较为单一，目前已发现的 AM 真菌有4 目11 科27 属，接近 300 种[17-18]。而本研究中鉴定到科级分类水平的仅有球囊霉目（Glomerales）的球囊霉科（Glomeraceae），其相对丰度占总reads 的2.27 ～2.39%，球囊霉目中有1.05 ～1.09%的reads 未能鉴定到科。属级分类水平上也未能获得AM 真菌的相关信息。

图 2 不同土壤样本群落结构分析

2.3 优势与共有菌种分析

维恩图（venn）可以反映环境样品的相似性及重叠情况。图3 为以OTU 97%相似水平得到的venn 图。

图 3 土壤样本微生物群落OTU 维恩图

如图3 所示，所有土壤样品中全部OTU 数目是314，其中3 个样本土壤中共有的OTU 为196 个，占总OTU 数目的62.42%，表明3 个样本的土壤样品中含有大量的相似物种，相似性较大。1 号样本土壤中特有的OTU 是22 个，2 号样本土壤中特有的0TU 是19 个，3 号样本土壤中特有的OTU 是16个，分别占对应土壤样品总OTU 的8.40%、7.54%、6.32%。共有的196 个OTU 中能确定种属分类地位的有48 个，大部分OTU 的分类信息不能明确。其中优势菌种是Boeremia exigua var. exigua（占总菌群的15.1%～16.88%）和腊叶芽枝霉（Cladosporium herbarum，占总菌群的13.25%～14.28%），另外除Bipolaris sorokiniana（占总菌群的3.66%～6.12 %）、Agaricus bisporus（占总菌群的2.53%～2.87 %）、Rhizoctonia solani（占 总 菌 群 的2.21% ～2.9 %）、Ramularia endophylla（占总菌群的1.04%～1.43 %）4 个物种的相对丰度在1%以上外，其余42 个OTU的相对丰度均小于1%。

2.4 组间群落结构差异分析

Heatmap 热图分析如图4 所示分别从门和属两个阶元层上对样品的分类单元（OTU） 类型进行聚类，结果显示1 和2 号样本中土壤真核微生物的组间差异相对较小，两者与3 号样本土壤比在物种组成上存在一定差异。PCA 分析如图5 所示不同样本出现分散或聚集的分布情况，PC1 轴解释的差异性为24.01%，PC2 轴解释的差异性为75.99%。主成分分析的目的在于分析确定样本中影响其真核微生物分布与结构的主要因素，从图中各样本与PC1、2两轴之间的距离远近可判定：影响1 号样本真核微生物分布与结构的主要因素是PC2，影响2 号样本真核微生物分布与结构的主要因素是PC1，3 号样本受PC1 和PC2 两个主成分的影响均不显著。1、2和3 号3 个样本没有聚集在一起且距离较远，表明三者组间差异较大。

图 4 土壤样本heatmap分析图

图 5 不同土壤样本PCA分析

3 讨论

土壤中蕴含着丰富和大量的微生物资源，其中真菌是土壤微生物中重要的一类成员，包括接合菌、担子菌、子囊菌、壶菌、球囊菌等，其中一般以子囊菌和担子菌类群居多[10]，有学者认为尽管不同土壤生境中微生物群落的整体组成差异可能较大，但优势菌群存在相似度较高的情况[19]。 近年来国内的诸多研究也表明植物根际的优势菌群属子囊菌和担子菌。如陈秀波等[20]采用基于ITS 序列的Illumina MiSeq 高通量测序技术，分析凉水国家级自然保护区的不同林型红松林土壤真菌群落组成和多样性，这些国内外的研究结果表明在已知真菌类群中，子囊菌门和担子菌门为优势菌门。 郭雄飞[21]以20 年生刨花润楠人工林为研究对象，分析了刨花润楠根系、根际土壤以及非根际土壤真菌群落结构，结果显示子囊菌门和担子菌门真菌为排名前两名的优势菌群。艾叶[22]等为研究竹叶兰（Arundina graminifolia）根系共生真菌的群落结构及对寄主的营养作用，采用高通量测序技术对野生竹叶兰根围土壤、根表、根内 3 个生态位真菌的种类鉴定后发现丰度排名最高的前20 种真菌仅分布在子囊菌门和担子菌门。喀斯特石漠化区域的土壤属劣质土壤，无论是从物理性质（粘度、结构、干湿度、可塑性等）还是化学成分（酸碱值、营养等）上均已极大程度的恶化。这样的土壤条件下，植物根际土壤的优势菌群情况如何？本研究的鉴定结果显示典型样本中子囊菌门占比最高，达69.23%～71.07%， 而相对丰度排第二的为担子菌门，但其占比仅为7.91%～8.61%。这一结果与段倩倩等[23]和黄化刚等[24]的研究结果较为一致, 而与何敏红[13]等鉴定的中度石漠化土壤中担子菌门相对丰度最大（59.7%）的结果差异较大。不同类群的真菌在土壤中功能有显著差别，其中担子菌与子囊菌在凋落植被分解过程中的角色就不同，担子菌对木质化成分较高的植物碎屑分解力较强，而从属腐生菌类群的子囊菌主要功能为分解植物残体和降解有机质[25,26]，本研究中土壤样本采集区主要植物为草本植物，凋落物中木质素含量较少，因此对于子囊菌的生长和繁殖是有利条件，另外子囊菌真菌适应性也较为广泛[27]，推测可能是样本中子囊菌占较高丰度的主要因素。近年来对退化土壤的研究报道中除未知菌种外，青霉属（Penicillium）和镰刀菌属（Fusarium）的菌种属较为常见的优势菌种[11,28-30]，本次研究样本中也含有大量的未鉴定的真菌类群，但较特别的是，其优势菌种为Boeremia exigua var. exigua 和腊叶芽枝霉，这一结果未见相似报道，Boeremia exigua var. exigua 和腊叶芽枝霉在文山石漠化土壤中的特有性对该区石漠化土壤的修复与植被生长是否存在特殊意义，有待进一步研究。

AM 真菌生态适应性强，可存在于各种生态环境中且物种多样性丰富，甚至在干旱、贫瘠、酸碱失衡等恶劣与退化生境中AM 真菌也广泛分布，对这些区域的生态恢复与重建具有明显的促进作用。国内外的诸多研究数据显示喀斯特石漠化地区AM 真菌多样性与丰富度均较高于非喀斯特对照地，原因可能是石漠化生态系统长期相互选择的结果[31-33]。 然而，本研究中3 个典型样本中检测到的球囊菌门菌群（AM 真菌类群）相对丰度较低，为3.40%～3.59%，其类型也比较单一，仅检出归属球囊霉目下的AM 真菌。分析原因可能与采样区植物类型和生长情况相关，3 个土壤采样区植物群落结构特征基本相似，主要生长植物类型为草本，少量灌木，不生长乔木，且植物生长稀疏，密度低。Hiiesalu 等[34]研究指出 AM 真菌物种丰度与植物物种丰度呈显著正相关关系。许多研究还发现AM 真菌具有强的植物偏好性[35]。因此推测采样区石漠化土壤持续退化可能与AM 真菌的影响有关。众所周知，AM 真菌的侵染起源于土壤[36]，土壤中AM 真菌的多样性亦是保证植物菌根生成和生长的必要前提。因此退化土壤中施入多种类型的AM 真菌可能成为治理石漠化的有效手段。