韭菜两新优品种叶片游离氨基酸总量测定与比较

张 伟,马培芳,李延龙,王雅丽,王继芸,张华敏,陈建华, 尹守恒,李克寒

(河南省韭菜工程技术研究中心/平顶山市农业科学院，河南 平顶山 467001)

氨基酸是蛋白质的组成基本单位，是人体必需的营养。而韭菜叶片中富含游离氨基酸是用来描述韭菜叶片营养价值的一个重要品质指标。韭菜主食叶片，进行游离氨基酸总量的测定是对韭菜叶片氨基酸营养的确定。航研998与平韭2号都是比较新出的品种，所以以这两个品种作为实验材料。

游离氨基酸与水合茚三酮反应，产生二酮茚—二酮茚胺蓝紫色化合物。在一定范围内，颜色的深浅与游离氨基酸含量成正比，可以用紫外可见分光光度计，在570 nm下测得蓝紫色溶液的吸光度，然后根据标准曲线计算样品中游离氨基酸的含量。

1 材料和方法

1.1 实验材料、仪器和试剂。

1.1.1 材料 新鲜韭菜叶片

1.1.2 仪器 主要有:

(1)研钵、漏斗、三角瓶、滤纸 、容量瓶(50 mL, 100 mL);

(2)橡胶塞刻度试管50 mL;

(3)移液枪200 μL、1 000 μL、5 000 μL;

(4)沸水浴电磁炉;

(5)UV-1600紫外可见分光光度计;

(6)分析天平。

1.1.3 试剂 主要有:

(1)10%乙酸。

(2)水合茚三酮试剂：称取0.6 g茚三酮加入15 mL正丙醇，再加入30 mL正丁醇及60 mL乙二醇溶解，最后在加入9 mL pH5.4乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于250 mL 广口棕色瓶于冰箱冷藏室内保存，10 d内有效。

(3)乙酸—乙酸钠缓冲液(pH5.4)：称取32.56 g乙酸钠(NaAc)，加入超纯水加热至沸，冷却后加30 mL冰乙酸，用超纯水定容至100 mL。

(4)氨基酸标准液：称取80℃烘干的L-亮氨酸(生物技术级)46.8 mg，以10%异丙醇溶解，并定容至100 mL，取此液5 mL用超纯水稀释至50 mL，即为每毫升含氨基氮5 ug的标准液。

(5)0.1%的抗坏血酸：50 mg溶于50 mL超纯水中，现用现配。

(6)60%乙醇[1]。

1.2 操作步骤

1.2.1 标准曲线制作 取6支50 mL刻度试管，按表1加入试剂后，混匀，盖上橡胶塞，置沸水浴中15 min，然后取出在冷水浴中迅速冷却，直到溶液呈蓝蓝紫色时，用60%乙醇定容至20 mL，摇匀，在570 nm下测吸光度。

表1 标准曲线的吸光度测定

表2 吸光度的计算

1.2.2 样品提取 新鲜叶片擦干净，取中部剪碎，称0.15 g，于研钵中加10%乙酸1.5 mL，研磨，转移至25 mL容量瓶中，用超纯水定容，然后在用干滤纸过滤至三角瓶中。

1.2.3 样品测定 样品滤液1 ml吸入20 mL具塞刻度试管中，加超纯水1 mL，水合茚三酮3 mL，0.1%抗坏血酸0.1 mL，显色、比色同标准曲线方法。并根据吸光度在标准曲线位置上计算出样品的含氮量X(ug)。

2 结果与分析

按照下式计算出100 g鲜样中氨基态氮的含量：

氨基态氮含量(mg·100g-1鲜样)=

2.1 实验结果

实验结果如表2。

表4 平韭2号与航研998的不同收割天数与每百克叶片的氨基态氮计算结果

2.2 结果分析

从实验结果看，航研998的百克叶片中游离氨基酸总量比平韭2号的多，也可以认为其游离氨基酸总量营养价值比平丰2号较高。在收割时比较航研998长势比平韭2号强许多，直立性好，分蘖性强。总之航研998与平韭2号在各方面相比较表现出来的是一个好品种。

3 讨 论

由于蛋白质和多肽中的游离氨基酸也会产生茚三酮的还原反应，因此，对于含大量蛋白质和多肽的样品，可以先用蛋白质沉淀剂将其除去。常用的蛋白质沉淀剂有10%乙酸，且乙酸提取总氨基酸的效果较好。

(1)实验用水为超纯水，若无可用无氨蒸馏水代替。

(2)实验中以抗坏血算为还原剂，可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，由于抗坏血酸可与茚三酮反应，使溶液颜色过深，需要掌握加入抗坏血酸的量，而且抗坏血酸必须现用现配。

(3)该反应需要脱水缩合，反应介质中水的多少不但对终点产物的浓度有很大影响，而且还会影响终点产物的稳定性[2]。因此，反应完后在反应中加入定量60%乙醇，用来稳定反应产物。

(4)水合茚三酮与氨基酸反应所生成的二酮茚—二酮茚胺在1h内是稳定的，故显色后的溶液加入60%乙醇稀释后尽快比色。