季节变化对德州驴精液品质的影响

李 敏 ，刘海兵，刘 冰，尹桂军，吴帅帅，于 杰，李 楠，李雪贤*

（1.国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东东阿 252201；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100083）

德州驴原产于山东省滨州市、德州市沿渤海各县，是中国五大优良驴种之一，体型高大，是我国传统的役肉兼用驴品种。然而随着农业和运输业迅速发展，驴的役用功能减弱，存栏量骤减[1]，德州驴也面临着种质资源退化和数量逐渐降低的严峻形势，目前已被列为国家级种质资源保护对象[2]。近年来随着经济的快速发展，消费者对驴皮制品（阿胶）、驴肉、驴奶的需求也逐年增加。大力发展德州驴的人工繁殖技术对解决供需矛盾，保护种质资源，提高养殖经济效益，具有重要意义。已有研究发现，公畜的精液品质受季节变化影响较大。夏季高温会导致种公畜精液质量暂时性下降[3-4]，而在冬季采集的精子密度最低，但其具有最佳的解冻活力，适宜进行冻精生产[5]。研究表明，品种、年龄、采精频率[6-7]等多种因素对种公驴精液品质和繁殖力均会产生深刻影响。但是关于季节对种公驴精液质量影响的研究鲜有报道。据此，本试验在常规饲养管理条件下，通过对比德州黑毛驴在不同季节的采精量、原精密度、精子活率及冷冻复苏率的变化，分析德州驴精液质量的季节性变化规律，为实际生产中合理使用种公驴（常规配种和冻精生产）提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及试验动物 选取东阿国家黑毛驴繁育中心的9 头种公驴，对其2016—2019 年春季（3—5 月）、夏季（6—8 月）、秋季（9—11 月）和冬季（12 月—次年2 月）的采精状况及生产性能指标进行跟踪与统计。所有种公驴均单栏饲养，圈舍干净整洁，定时运动保健。每头种公驴每周采精不超过3 次。

1.2 试验材料与试剂 电热恒温水浴锅（DK-8B；上海精宏实验设备有限公司）、显微镜、精子密度测定仪（RS232；法国卡苏科技股份有限公司）、程序冷冻仪（德国米尼图Minitube 公司）、计算机辅助精子活力分析仪（AndroVision ™；德国米尼图Minitube 公司）、假阴道、集精杯、载玻片、盖玻片、液氮罐等仪器设备。试剂配置所需青霉素、链霉素购自Amresco 公司，葡萄糖、果糖、柠檬酸、甘油等均购自Sigma 公司。

1.3 精液样品的采集、测定及冷冻 通过假阴道刺激法采集种公驴精液，将消毒后的采精筒加入45～50℃温水保温，采集的精液收集至底部集精杯中，纱布过滤至37℃预热的玻璃量筒中，记录原精体积。移液枪取7 μL原精，滴至预热的载玻片上，压片后，显微镜下观察精子形态，并使用计算机辅助精子活力分析仪（CASA）检测精子活率，记录精子快速前进运动活力。吸取120 μL原精加入3 mL 生理盐水中，混匀，使用精子密度仪测量原精密度。按1:1 的比例将原精与预热基础液（含Trizma Base、葡萄糖、柠檬酸、青霉素、链霉素）混匀[8]，23℃静置10 min。然后600 g×离心10 min，去掉上清液。用冷冻保存液（含葡萄糖、Trizma Base、柠檬酸、卵黄、甘油）重悬精子，调整密度至1×108个/mL，灌装入0.5 mL冻精细管中，将其置于4℃平衡柜中恒温约3 h。随后使用全自动程序冷冻仪快速冷冻细管冻精，进行三步降温（从4℃到-10℃降速为-5℃/min；从-10℃到-100℃降速为-40℃/min；从-100℃到-140℃的降速为-20℃/min），冷冻程序结束后，将细管冻精投入液氮保存。每批细管冻精均抽样并在37℃水浴锅中迅速解冻30 s，检测精子解冻活力。

1.4 统计分析 所有数据均以平均值± 标准差表示。采用SPSS 20.0 软件中的单因素方差分析（One-Way ANOVA）以及Duncan's 多重比较对所得数据进行显著性检验分析。当P＜0.05 时表示差异显著。

2 结果

2.1 东阿县2016—2019 年各月份的平均气温 由表1可知，国家黑毛驴繁育中心所在的东阿县6—8 月的平均高温均超30℃，足以引起种公驴的热应激，而12 月至次年2 月的平均低温持续在0.5℃以下，易造成种公驴的冷应激。

2.2 采精季节对种公驴精液量的影响 如图1 所示，种公驴精液采集量在春季与夏季达到最大值，平均射精量均超过56 mL，二者之间不存在显著差异，但均显著高于秋季和冬季的采精量。种公驴采精量在夏季后开始显著下降并在冬季达到最低值，冬季平均射精量仅为42.5 mL，显著低于其他三季，与射精量最大的夏季相比，下降幅度超过25%。

图1 不同季节种公驴总精液量的变化

2.3 采精季节对种公驴精子密度的影响 如图2 所示，种公驴原精中精子密度在春季时最小（3.04×108/mL），且显著低于其他季节；在秋季达到最大值（3.81×108/mL），显著高于春、夏、冬3 个季节；另外，夏季和冬季采集精液中的精子密度介于春季与秋季之间，但二者之间差异不显著。

图2 不同季节种公驴精液中精子密度的变化

2.4 采精季节对种公驴精子活力的影响 如表2 所示，秋季原精活力最高，平均活力超过0.88，高于其他季节（P＜0.05），夏季种公驴原精活力最低。

而经过冷冻再解冻后，种公驴精子冻后活力由春季的0.63 下降至夏季的0.57（P＜0.05）。与夏季相比，秋季精子冻后活力提升（P＜0.05），接近于春季水平，但进入冬季后，种公驴精子的冻后活力再次急剧下降，仅为0.49，且低于其他各个季节（P＜0.05），与冻后活力最佳的春季相比，活力降低约22%。

2.5 采精季节对种公驴细管冻精成品率的影响 如图3 所示，种公驴精子冷冻复苏率在夏季时最低，仅为73.8%，显著低于其他季节。而春、秋两季，冷冻复苏率均处在较高水平（超过78.7%），且二者之间无显著差异。进入冬季后，随着气温降低，冷冻复苏率再次下降，低于春季（P＜0.05）和秋季而高于夏季（P＜0.05）。

表1 东阿县2016—2019 年各月份的平均气温 ℃

表2 不同季节对采集种公驴精子活力的影响

图3 不同季节种公驴精子冷冻复苏率的变化

3 讨 论

季节变化对公畜繁殖性能的影响已在许多动物上得到验证。众多研究表明，炎热季节造成的热应激对种公畜的繁殖机能产生巨大影响，严重影响公畜的精液品质，降低种公畜的利用效率[9-10]。而另有研究证实，寒冷环境导致的冷应激也会对精子的发生和活率产生干扰，从而影响公畜的繁殖性能[11-12]。本研究试图描述出种公驴精液质量的季节性变化，明确季节对公畜精液各项指标的具体影响。

公驴的精子是由位于体表的阴囊内的睾丸产生，该处皮肤较薄，容易受到外界环境干扰，若睾丸所处的环境温度过高或过低，均会对精子的发生和机能产生不利影响。已有研究发现，夏季高温会导致公畜射精量增大，精子密度下降，但进入冬季后，公畜总精液量急剧减少，精子密度却达到最大，二者之间呈现显著负相关[4,13]。Carluccio 等[14]研究表明，季节变化对公驴睾丸形态特征并无显著影响，但与其他季节相比，冬季采精，会产生更多的精液，精液密度更小。在本研究中，德州种公驴的射精量和原精密度受季节性因素影响明显，其在冬季射精量最小，夏季射精量最大，与春、秋季差异显著，种公驴原精密度在秋季时最高，春季时最低，均与其他季节差异显著。导致德州驴与上述研究结论差异的原因可能是由于不同品种对气温的适应性存在差异。季节对种公畜射精量和精子密度的影响可能是由于夏季公畜副性腺分泌液增加导致精液量增加，而高温影响睾丸的生精机能，导致原精密度下降[15]，进入秋季后，气温适宜，睾丸恢复正常功能，射精量和精子密度趋于正常水平。

已有研究表明，相比于炎热的夏季和寒冷的冬季，在气温适宜的3—5 月，种马具有更好的原精活力、更高的顶体完整性和线粒体膜电位[9]。Bhakat 等[13]研究发现，湿热和干热的季节公牛的原精活力均显著低于凉爽的秋冬季节，推测是由于在高温环境下，附睾内精子的呼吸作用增强，大量消耗能量物质，使精子受损，导致排出的精子活力大大降低。但在非洲驴上的研究发现，季节对于公驴的原精活力并不产生显著影响，但其在秋冬季节拥有更低的平均路径速度（Average path Velocity，VAP）和 曲线速度（Curvilinear Velocity，VCL）[14]。本试验结果与以上研究相似，种公驴在秋季原精活力最高，而在夏季，虽然原精活力降低，却与春季、冬季无明显差异，说明温度对公驴原精活力的影响有限。

大量研究表明，极限环境下，公畜的原精活力、冻精活力均显著降低[3,16-17]。Wrench 等[18]研究发现，与非繁殖季节（9 月和12 月）相比，繁殖季节（3 月和6月）的种公马冻后精子活力更高，推荐在北半球的3—6 月进行马精液的冷冻保存。谢庄等[19]测定结果表明，夏季生产的冻精解冻活力最低，而冬季的精液耐冻性能较好，解冻活力最高。而Murphy 等[5]研究证明，虽然冬季采集的公牛精子密度最低，但具有最佳的解冻活力，适宜进行冻精生产。本研究发现，种公驴精子的冻后活力在夏季和冬季显著低于其他季节，可能与这两个季节极端的气温有关。而计算冷冻复苏率发现，夏季冻精的复苏率依然最低，但在冬季，虽然精子活力不佳，冷冻复苏率却显著高于夏季，提示精子对于冷应激的耐受度可能高于热应激。

4 结 论

本研究发现，热应激和冷应激均对公驴的精液质量产生明显的负面影响，春季和秋季是优质精液生产的最有利季节；冬季较高的冷冻复苏率提示，采取相应措施后，可在非繁殖季节采精以提高种公驴利用率。综上所述，在高温与严寒时节，对种公驴舍和采精室应采取降温和保温措施，保证稳定的精液质量，提高种公驴配种效率，精液的利用率。