美极梅奇酵母的代谢特性及其在葡萄酒生产中的应用前景

孙玉霞，赵新节

1(山东省农业科学院农产品研究所，山东省农产品精深加工技术重点实验室，农业部新食品资源加工重点实验室，山东 济南，250100)2(齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院，山东 济南，250353)

近年来，学者对非酵母属酵母(non-Saccharomyces)在葡萄酒酿造中的作用进行了广泛的研究[1-2]。大多数的非酵母属酵母都会对葡萄酒产生负面影响，如假丝酵母属(Candida)，毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula)能在葡萄酒表面形成菌膜；酒香酵母(Brettanomyces/Dekkera)污染葡萄酒，会给葡萄酒带来 “马厩、老鼠” 等不良的气味，产生风味缺陷[3]；葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum/Kloeckeraapiculata)会在酒精发酵的初期产生较多的乙酸和乙酸乙酯[4]，进而影响葡萄酒质量。但是，有些种的非酵母属酵母或菌株则会对葡萄酒产生有益影响[5]，美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)就是其中一个重要的种。

美极梅奇酵母(M.pulcherrima)(无性型为Candidapulcherrima)属于梅奇酵母科(Metschnikowiaceae)，梅奇酵母属(Metschnikowia)，是该属中的第一个被描述的种[6]。美极梅奇酵母广泛地分布于自然界，是一种在成熟葡萄浆果表面常见的野生酵母，在葡萄酒发酵的初级阶段也普遍存在[7]。本文重点介绍了美极梅奇酵母的生理特性及其对葡萄酒生产影响的相关研究进展，为其在葡萄酒生产中合理应用和特色葡萄酒的研发提供参考。

1 美极梅奇酵母的特性

1.1 对环境的适应性

1.1.1 温度

温度条件对美极梅奇酵母的生长有着较大的影响。梅奇酵母属对高温的适应能力，存在着种或菌株间的差异和起源地的差异，例如从热带地区分离到的1株M.persimmonesis菌株可以在40 ℃的条件下生长[8]。在PAWLIKOWSKA等[9]的试验中，多数梅奇酵母属菌株的生长温度范围在8～30 ℃，15～30 ℃是其最佳生长温度。参与试验的美极梅奇酵母菌株对高温的适应性和其他试验菌株没有明显差异，不能够耐受37 ℃，但是菌株NCYC747、CCY 29-2-147和CCY29-2-149却显示出了对低温的良好适应性，在2 ℃的条件下仍能生长。

1.1.2 pH

美极梅奇酵母在pH值4～8的培养基中均能良好的生长[10]，但对高低限的适应性存在菌株差异性，多数菌株对低pH具有较好的耐性，在pH 3条件下能够生长良好[9]，甚至在pH 2的条件下也能生长[11]。

1.1.3 渗透压

美极梅奇酵母菌株大都具有相对较高的渗透耐受性，例如在PAWLIKOWSKA等[9]的研究中，菌株NCYC2321和NCYC747表现出了较强的抗渗透胁迫能力，在30%的葡萄糖条件下仍有较好的生长。

1.1.4 酒精

美极梅奇酵母对酒精的耐受能力相对较低，多数菌株发酵产生的酒精体积分数在3%～6%[9,12]。但是，也发现一些菌株能够耐受体积分数高达9%的酒精[13]，SADUDI等[14]曾经证明有的菌株可以产生大约10%酒精。

1.1.5 碳氮营养

美极梅奇酵母在蔗糖为碳源条件下的生长与其在葡萄糖条件下的生长相似，尽管表现出对蔗糖吸收缓慢和消耗不彻底，仍证明其具有蔗糖转化酶活性。试验表明美极梅奇酵母在酵母浸提物、玉米浆、硫酸铵、磷酸二铵等不同氮源下都能够良好生长，但是在酵母浸提物为氮源时表现出了最大的生物生长量，认为与酵母浸提物中含有微量元素、维生素和氨基酸有关；在进一步的酵母可同化氮含量试验中，100、200和500 mg/L水平之间没有明显差异[11]。KEMSAWASD等[15]研究了19种氨基酸、硫酸铵及其混合的氮源对不同酵母菌株生长及发酵性能的影响，发现谷氨酸和硫酸铵最利于加快美极梅奇酵母的生长速率，而半胱氨酸、组氨酸和苏氨酸则具有减缓作用；丙氨酸、天冬酰胺和氨基酸与硫酸铵混合氮源显著增加了乙醇产量，而半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸则降低了乙醇产量。

1.2 酶活性

酶在葡萄酒的酿造中起着重要的作用，在酿造过程中的成分转化、澄清过滤、香气释放、色泽稳定、提高感官品质等方面都扮演着重要角色。葡萄酒酿造中的酶主要来自于葡萄果实、微生物，也可以添加商业酶制剂。在酿酒过程中酵母产生的胞外酶对葡萄酒的感官特性具有重要影响[16]。

1.2.1 葡萄糖苷酶(glucosidase)

美极梅奇酵母具有α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶[9,17]活性。β-葡萄糖苷酶能够促进葡萄品种香气(尤其帖烯化合物)的释放，增强葡萄酒的香气，对葡萄酒生产具有重要意义。美极梅奇酵母是能够产生β-葡萄糖苷酶的一个主要酵母种[18]，ESCRIBANO等[17]在对97个非酵母属酵母菌株(其中美极梅奇酵母菌株6个)酶活性的分析中发现，美极梅奇酵母具有β-葡萄糖苷酶活性的菌株比例最高(63%)，其次是隐球酵母属(60%)，其他多数酵母则没有或仅有极少比例的菌株具有该酶活性。GONZALEZ-POMBO等[19]对美极梅奇酵母β-葡萄糖苷酶进行了纯化和特性分析，该酶在50 ℃、pH 4.5时具有最佳的催化活性，主要作用于1-4和1-2 β-糖苷键，其活性受锌离子的抑制。在23 ℃和pH 4.5的条件下，12%(体积分数)的乙醇对酶的稳定性没有影响，但是当pH值低于4.0时，酶就会出现沉淀而失活。这一特性将是葡萄酒生产中应用其β-葡萄糖苷酶作用的障碍，因为一般情况下葡萄酒的pH值都在4.0以下。但是对pH的适应性表现出了较大的菌株差异性，有些菌株在pH 4和pH 6时的β-葡萄糖苷酶活性并没有区别。

1.2.2 碳水化合物水解酶(carbohydrolases)

果胶酶(pectinase)、纤维素酶(cellulase)、木聚糖酶(xylanase)和葡聚糖酶(glucanase)等对葡萄的细胞壁均具有降解作用，有利于色素、单宁、香气等风味成分的浸渍和葡萄酒的澄清过滤[20]。ESCRIBANO等[17]的研究结果显示，供试的美极梅奇酵母中69%的菌株具有果胶酶活性，37%的菌株具有纤维素酶活性，6%的菌株具有葡聚糖酶活性，没有发现具有木聚糖酶活性的菌株。有的美极梅奇酵母菌株还具有较高的几丁质酶(chitinase)活性，这使其具有在葡萄果实真菌病害生物防控方面的应用潜质[21]。酿酒葡萄在成熟期的一些病害能给葡萄酒带来严重危害，例如灰霉病(Botrytiscinerea)会产生漆酶，产生难以控制的氧化，影响葡萄酒品质；葡萄表面的曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)是产生赭曲霉毒素的主要霉菌，也是葡萄酒安全的重要隐患。美极梅奇酵母具有几丁质酶活性的特点，或许能为酿酒葡萄原料的健康保障提供新的思路。

1.2.3 羟基肉桂酸脱羧酶(hydroxycinnamic acid decarboxylase，HCDC)

具有HCDC活性的酵母菌可以使羟基肉桂酸脱羧并形成乙烯基酚，其与葡萄花色苷结合生成吡喃花色苷可以显著提高颜色的稳定性。BENITO等[22]的研究表明，使用具有高HCDC活性的非酵母属酵母进行混合发酵，增加了稳定色素的含量。除此之外，具有高HCDC活性的非酵母属酵母还能够降低香豆酸的含量，可以减少因酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces)污染引起的4-乙基酚(4-ethylphenol)形成[23]。HCDC活性不是某一属或种的特性，而是取决于酵母菌株[24]。在ESCRIBANO等[17]的研究中，发现美极梅奇酵母50%的菌株具有HCDC活性。

1.2.4 蛋白酶(protease)

属于蛋白水解酶的芳基酰胺酶(arylamidases)或氨基肽酶 (aminopeptidases)催化肽中N末端氨基酸的水解，既可以增加葡萄酒中氨基酸的含量和促进香气成分的形成(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸等是酵母代谢产生的芳香化合物前体)，也有助于减轻葡萄酒的蛋白质不稳定性[25-26]。美极梅奇酵母多数菌株(94%)具有亮氨酸芳基酰胺酶活性、44%的菌株具有缬氨酸芳基酰胺酶活性[17]，也被发现具有天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)活性[27-28]，THERON等[28]的试验显示，天冬氨酸蛋白酶在30～50 ℃活性较强，最佳活性温度为40 ℃，在40 ℃的温度下，pH 4.5时活性最高，pH 3.5～5时活性保持在80%以上。在pH值高于6或低于3.5时，活性被显著抑制。钙、铁、镁、锌等离子对酶活性没有明显的影响，而锰、铜和镍有明显的影响，锰对酶的活性有轻微的抑制作用，铜和镍分别抑制其活性47%和25%。同时，乙醇和糖对蛋白酶活性均有抑制作用，在6%、12%和15%的乙醇体积分数下，活性损失分别达到50%、83%和92%；在100、200和300 g/L的糖质量浓度下，活性分别降低了11%、26%和40%。

1.2.5 其他酶

酯酶(esterase)催化酯的合成与水解，对葡萄酒的发酵香气具有重要作用，在葡萄酒相关酵母中普遍存在。在ESCRIBANO的研究中，参与试验的美极梅奇酵母100%的菌株具有酯酶活性和酯酶脂肪酶(esterase-lipase)活性；脂肪酶(lipase)会增加葡萄酒中游离脂肪酸的浓度，多数美极梅奇酵母菌株不具有脂肪酶活性[18]，但是，GOLDBECK等[29]筛选到了具有脂肪酶活性的美极梅奇酵母菌株，其最适酶解条件为pH 7.0和温度44 ℃，最高酶解活性达4.88 U/mL。β-裂解酶(β-lyase)与硫醇类品种香气的释放有关，有些美极梅奇酵母菌株具有β-裂解酶活性[13]。

1.3 嗜杀性

在研究葡萄酒发酵过程中美极梅奇酵母与其他酵母之间的相互作用时，美极梅奇酵母表现出了明显的嗜杀活性，具有天然的抗菌作用[30]。这种抗菌活性与其分泌的一种美极酸(pulcherriminic acid)有关，这种酸与介质中的铁离子螯合形成红色的美极素(pulcherrimin)，正是这种对铁离子的固化作用形成了缺铁的生长环境，抑制了对铁离子有更多需求的微生物生长[31-32]。美极梅奇酵母对假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、酒香酵母(Brettanomyces/Dekkera)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、类酵母菌属(Saccharomycodes)、有孢圆酵母属(Torulaspora)都显示了不同程度的抗菌活性，尤其对容易给葡萄酒产生不良作用的酒香酵母、有孢汉逊酵母、毕赤酵母等具有广泛的抗性，对灰霉菌(Botrytiscinerea)、青霉菌(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、丛梗孢属(Monilia)也具有抑制能力[33-34]。美极梅奇酵母不同菌株之间抗菌活性有较大的差异，其他非酵母属酵母不同的种或菌株对美极梅奇酵母的敏感性也有较大的差异。但是，美极梅奇酵母对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)没有拮抗作用[34]，这可能是由于酿酒酵母AFT1转录因子增加了铁离子调节基因的表达水平[35]。在酒精发酵前期应用嗜杀酵母控制腐败微生物的繁殖，是保证葡萄酒品质的一个有效措施。美极梅奇酵母的这一特点，更加突出了其与酿酒酵母协同发酵的潜质。

2 美极梅奇酵母对葡萄酒发酵及其成分的影响

2.1 发酵动力

与酿酒酵母单独发酵相比，美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵，大多减缓了发酵进程，消耗糖的速率变缓。SADOUDI等[36]选用美极梅奇酵母菌株MCR24和酿酒酵母菌株PB2023进行顺序接种发酵和酿酒酵母纯种发酵的试验，酿酒酵母纯种发酵3 d后达到最大细胞量，并一直维持到发酵结束，在8 d内完成了酒精发酵；而在顺序接种发酵过程中，美极梅奇酵母对酿酒酵母的生长没有影响，美极梅奇酵母接种后细胞数量没有明显的增加，但是在接种酿酒酵母后2 d显著下降，8 d后未检测到活细胞，糖的消耗速率比纯种发酵迟缓，酒精发酵在10 d内完成。酿酒酵母纯种发酵时葡萄糖的下降速度明显快于果糖，顺序接种发酵时，在接种酿酒酵母前2种糖的下降速度基本没有差异，而接种酿酒酵母后，尤其是美极梅奇酵母细胞数量显著下降后，表现出葡萄糖的下降速度明显快于果糖。在VLADIMIR等[37]的试验中，也是单一酿酒酵母或贝酵母的酒精发酵速率都很快，在6 d内消耗了绝大部分可发酵糖，剩余的含糖量大约为2.5%(质量分数)，随后发酵速率减缓，在第9天完成发酵。对于美极梅奇酵母参与的顺序接种发酵，在接种酿酒酵母或贝酵母菌之前，美极梅奇酵母发酵导致糖含量的下降比较少，接种酿酒酵母或贝酵母后，糖的消耗速率才加快，在第9天完成发酵，与酿酒酵母或贝酵母单一发酵完全结束的时间基本一致。至于在顺序发酵中，接种酿酒酵母后美极梅奇酵母细胞数量下降的机理与酒精浓度的耐受性没有关系，因为试验菌株曾被证明可以产生大约10%(体积分数)乙醇[14]，应该是酵母细胞之间营养竞争机制所致[38]， 酿酒酵母的生长速度快于美极梅奇酵母，因此可能使介质贫瘠化。

2.2 对发酵产物的影响

2.2.1 酒精

美极梅奇酵母与酿酒酵母混合发酵，一般情况下可以使葡萄酒的酒精含量降低0.6～1.6%[37,39-40]。在CONTRERAS等[39]的研究中，用所选的美极梅奇酵母菌株AWRI1149和酿酒酵母菌株间隔3 d顺序接种发酵生产的葡萄酒乙醇(体积分数)低于酿酒酵母纯种发酵生产的葡萄酒(霞多丽下降了0.9%，西拉下降了1.60%)；在VLADIMIR等[37]的试验中，也是单一商业酿酒酵母菌株发酵产生的乙醇(体积分数)最高(11.92%)，美极梅奇酵母、贝酵母和酿酒酵母顺序接种的葡萄酒中乙醇(体积分数)最低(11.01%)。在菲德乔(Verdejo)葡萄的顺序接种发酵试验中，美极梅奇酵母参与发酵比酿酒酵母纯种发酵的酒精含量降低0.62%～0.63%[40]。发酵介质中的溶氧量对美极梅奇酵母的降酒精作用具有显著影响，在高氧条件下混合发酵可以降低酒精含量3.7%左右，但会产生较高的挥发酸；而在几乎没有溶解氧的优化条件下，可以降低挥发酸，仅产生0.35 g/L乙酸，酒精含量降低2.2%[41]。

2.2.2 甘油

美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵比酿酒酵母单独发酵的甘油产量普遍有明显的增加，增加量一般在0.3～1.1 g/L[36-37,40]。美极梅奇酵母对甘油产量的影响与初始接种菌株的比例有关，在美极梅奇酵母接种量一定的情况下(107cell/mL)，甘油产量随着酿酒酵母接种量的减少而增加[42]。另外不同葡萄品种也有不同的表现，选用美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵，霞多丽平均增加了0.62 g/L，但在西拉的发酵中没有增加[43]。在美极梅奇酵母参与的酒精发酵中，甘油产量的增加，可以解释为在与美极梅奇酵母共同酒精发酵期间的渗透诱导致使GDP1基因在酿酒酵母中的过表达所致[36]。

2.2.3 高级醇

美极梅奇酵母参与顺序发酵对高级醇既有降低的影响，也有增加的影响，但是增加的幅度一般较小，这主要是由于菌株间差异的影响。在PARAPOULI等[44]的试验中，美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵显示了显著的降低高级醇的效果，连续3个年度总高级醇含量分别降低了163.4、223.9和10.5 mg/L，主要体现于异戊醇和异丁醇。VARELA等[43]对霞多丽和西拉2个葡萄品种试验也显示了对高级醇的减少作用，顺序发酵使霞多丽的总高级醇下降19.62 mg/L，主要是异戊醇下降了76.43 mg/L，苯乙醇下降了12.92 mg/L，异丁醇反而增加了69.36 mg/L；西拉的总高级醇含量下降了29.65 mg/L，其中异戊醇下降了37.51 mg/L，异丁醇下降了28.12 mg/L，而苯乙醇反而增加了35.97 mg/L。VLADIMIR等[37]的试验数据显示，高级醇类主要有异戊醇、辛醇、异丁醇、庚醇和苯乙醇，还有少量的癸醇、丙醇和壬醇，美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序接种发酵的总高级醇比酿酒酵母纯种发酵略高，分别是99.4和93.4 mg/L，差异比较明显的是庚醇和异戊醇，但是壬醇减少；美极梅奇酵母与贝酵母顺序接种发酵产生的高级醇比贝酵母纯种发酵略低，分别是92.3和100.1 mg/L，差异比较明显的是庚醇和丙醇。

2.2.4 乙酸

挥发酸是衡量葡萄酒质量的一个重要参数，一般情况下，挥发酸的80%以上成分是酒精发酵副产物乙酸。美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵普遍具有降低乙酸的作用[36,42]。乙酸产量的降低，可能是酵母之间的相互作用影响乙酸代谢途径所致。在SADOUDI等[36]的试验中，纯种酿酒酵母发酵，57%的乙酸最终产量是在发酵的前3 d产生的，而美极梅奇酵母和酿酒酵母顺序接种，从发酵开始就减少了乙酸的产生。

2.2.5 酯类及其他

美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序接种发酵一般会产生较高的酯类物质含量，主要体现于甲基丁酯、甲基丙酯和苯乙酯含量[45]，但会降低乙酸乙酯含量[43]。但某些菌株也会增加中链脂肪酸的含量，尤其是己酸和辛酸[43,45]，己酸带来类似于脂肪和奶酪的气味，辛酸会产生腐败的刺鼻气味，含量过高则会产生不良影响。

2.3 美极梅奇酵母对葡萄酒风味及色泽的影响

2.3.1 风味

近10多年的研究证明了美极梅奇酵母能够明显地提高葡萄酒风味品质，与酿酒酵母单独发酵葡萄酒相比，美极梅奇酵母和酿酒酵母顺序接种发酵提高了葡萄酒感官分值，突出了葡萄品种香气[40,44-45]。但是也有一份研究报告中显示美极梅奇酵母参与发酵对霞多丽葡萄酒产生了负面影响，与酿酒酵母发酵葡萄酒相比，反而降低了霞多丽葡萄酒的感官分值[46]。美极梅奇酵母对葡萄酒风味的贡献，一方面是由于其改变了葡萄酒中酯类、醇类等发酵产物的构成，增加了葡萄酒的香气复杂性，另一方面是由于酵母细胞中酶的作用，尤其是β-葡萄糖苷酶和β-裂解酶，促进了葡萄品种香气的释放。葡萄品种香气成分以萜烯类和硫醇最具代表性，在果实中多以结合态形式存在，在葡萄酒发酵过程中由不同的酵母水解酶催化释放。RODRIGUEZ等[47]以亚历山大麝香葡萄品种(Muscat d′Alexandrie)为原料，研究了美极梅奇酵母与酿酒酵母的联合发酵方式，认为顺序接种发酵效果最好，发酵的酒具有较高的高级醇、酯类和萜类化合物含量，表现出最强的果香和花香，这是由于美极梅奇酵母菌株具有的β-葡萄糖苷酶活性和β-木糖酶活性促进了芳樟醇、香叶醇和橙花醇等游离态单萜化合物的释放。RUIZ等[40]以菲德乔葡萄品种为原料研究了美极梅奇酵母对硫醇类香气化合物释放的作用，与2株酿酒酵母纯种发酵相比，美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序接种发酵的酒样中3-巯基-1-己醇(3-sulfanylhexan-1-ol，3-SH)的含量有所降低，但仍显著超过其嗅觉阈值(60 ng/L)，3-SH衍生化合物3-巯基乙酸己酯(3-sulfanylhexyl acetate，3-SHA)的浓度也显著降低。但是，4-巯基-4-甲基戊-2-酮(4-methyl-4-sulfanylpentan-2-one，4-MSP)的最终含量表现出了极显著的提高，其中一个酿酒酵母菌株(ScR)纯种发酵酒样中的4-MSP浓度很低，略高于嗅觉阈值(3 ng/L)，另一个酿酒酵母菌株(ScD)发酵的酒样中未检测到，而2个有美极梅奇酵母参与顺序接种发酵的酒样中的4-MSP浓度比酿酒酵母菌株(ScR)纯种发酵酒样高6.4倍，平均值为28.05 ng/L。这种促进硫醇化合物释放、增强品种特征香气的效果，既与美极梅奇酵母菌株具有β-葡萄糖苷酶活性有关，也与C-S-裂解酶活性有关。另外，以美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序发酵生产起泡葡萄酒基酒，可以增加起泡葡萄酒泡沫的持久性，增加了多糖含量，同时增强了酒的花香和烟熏风味[48]。

2.3.2 色泽

美极梅奇酵母与酿酒酵母顺序接种发酵能够产生较多的乙醛和乙烯基酚，可以促进红葡萄酒色素的稳定[49]。在酒精发酵和陈酿过程中花色苷与丙酮酸、乙醛或乙烯基酚类化合物缩合而形成的吡喃花色苷具有更好的稳定性，能够保护颜色免受二氧化硫、温度、氧化和pH变化的影响。吡喃花色苷主要有两种类型：一类是由花色苷与丙酮酸或乙醛缩合形成，一类是由花色苷与乙烯基酚类化合物反应生成，正是美极梅奇酵母的HCDC活性促进了乙烯基酚的产生[50]。美极梅奇酵母对葡萄酒色泽的有益作用还有另外一种机制，在葡萄酒酒精发酵过程中，酵母对花色苷都有一定的吸附作用，酿酒酵母对花色苷的吸附量一般在总花色苷的1%～6%，对某些特定花色苷的吸附甚至会高达30%。而美极梅奇酵母由于其细胞壁结构组成的不同，对花色苷的吸附量较少，相对减少了葡萄酒色素的损失[51]。

3 结语

美极梅奇酵母是葡萄园与葡萄酒生产过程中普遍存在的一种非酵母属酵母，对葡萄酒的生产环境具有良好的适应性，耐酒精、低温、低pH和较高的渗透压，具有β-葡萄糖苷酶、羟基肉桂酸脱羧酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、酯酶等多种酶活性，又具有独特的嗜杀抗菌特点，能够抑制不良酵母或真菌对葡萄酒的污染。在降低葡萄酒酒精含量、增加甘油含量、增强品种香气、提高感官品质、促进红葡萄酒色泽稳定等方面具有良好的潜质。但是，美极梅奇酵母的一些特性存在着较大的菌株差异性，有的菌株还会产生过高的脂肪酸含量，对葡萄酒的品质产生负面影响，因此，开展适宜菌株的筛选与功能优化是其在葡萄酒生产中应用的基础工作。