β1、β2肾上腺素能受体在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义

陶识丞 刘诗奇 张翀 马振 陈国生 黄应斌 刘海峰 麦华明

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科；广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室；广西高校颌面外科疾病诊治研究重点实验室；广西颅颌面畸形临床医学研究中心

口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部恶性肿瘤常见的组织病理学类型，约占90%［1］。在临床上口腔鳞状细胞癌发现及诊断较晚，且易发生淋巴结和远处转移，这是致使预后较差的重要原因［2］。近年来学者们不断探寻用于口腔鳞状细胞癌临床诊疗和预后判断的有效指标。β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）是 7 跨膜受体家族的成员之一，分为 β1、β2、β3亚型，可介导内源性儿茶酚胺而作用于多种靶细胞。研究发现 β-AR 在黑色素瘤［3］、肝癌［4］、胃癌［5］、卵巢癌［6］等多种肿瘤组织中过表达。β-AR信号通路也被发现与肿瘤增殖、凋亡［7-9］、微环境的调节［10-11］等密切相关。本研究通过检测β1-AR和β2-AR在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，并分析其与临床病理特征及预后的相关性，为口腔鳞状细胞癌寻找新的潜在预后评估及治疗靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科2017年7月至2018年7月收治的60例口腔鳞状细胞癌患者癌组织及相应癌旁组织（距癌组织约2 cm）。纳入标准：⑴初治并经组织病理学检查确诊的口腔鳞状细胞癌患者；⑵术前未接受放疗、化疗及免疫治疗等抗肿瘤治疗；⑶实验室检查、影像学检查等临床资料齐全；⑷根据国家癌症综合网络指南，治疗方案包括标准肿瘤切除术、颈清扫和术后放化疗。排除标准：⑴合并其他恶性肿瘤；⑵合并急性炎症疾病或可能影响血清生化水平的血液学疾病，合并严重心、肺、脑疾病者。60例患者的中位年龄为54岁，≤54岁31例；男性39例；有淋巴结转移30例；颊癌7例，口底癌6例，舌癌 32例，牙龈癌 12例，腭癌 3例；肿瘤大小≤4 cm 41例；高分化49例，低中分化11例；头颈癌TNM新分类（AJCC2018）标准临床分期Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期44例。同时收集同期于本院就诊的15例非口腔鳞癌患者的口腔正常黏膜上皮组织。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 随访

采用电话、门诊复查等随访方式。以手术日为随访起点，术后2年内每3～4个月随访1次，2年后每半年随访1次，随访截至2020年7月，随访时间为3～36个月，中位随访时间20个月。随访期间术后复发 16例（26.6%），死亡 10例（16.7%），无失访病例。总生存期（OS）定义为手术日至死亡或最后随访日期的时间，无进展生存期（PFS）定义为手术日至第一次疾病进展或任何原因死亡的时间。

1.3 RT-qPCR检测β1-AR、β2-AR mRNA表达水平

RNA提取及cDNA反转录均按照说明书进行。PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上游与下游引物分别 0.8 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，DNA 模板 2 μL，dH2O 6 μL，共 20 μL。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共 40个循环。根据NCBI相应的序列，按照引物设计原则，由大连Takara合成，β1-AR基因上游引物为5′-GCCATGGACAAGCTGAGGAAG-3′，下游引物为 5′-GTGCTGATGTACCAGTTGGG-3′；β1-AR 基因上游引物为 5′-TTAGCCAGGTGGAGCAGGATG-3′，下游引物为 5′-GCCTAACGTCTTGAGGGCTTTG-3′；GAPDH 上游引物为5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物为 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。溶解曲线鉴定RT-qPCR产物，以2-△△Ct计算相对表达量。实验重复3次。

1.4 Western blot检测β1-AR、β2-AR蛋白表达水平

提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，绘制标准曲线，并计算样品浓度。SDS变性蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳跑胶，将目的条带转至PVDF膜，用5%脱脂奶室温封闭 1 h；加入一抗［Anti β1-AR（ab103653）、Anti β2-AR（ab182136），购自美国abcam公司），稀释比例为 1∶500］4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；加入二继续卵孵抗滴加ECL发光液，凝胶成像系统显影，用Image J对目的条带进行灰度光密度分析。以GAPDH为内参蛋白。

1.5 统计学方法

采用SSPS 22.0软件进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差表示，配对资料的组间比较采用配对t检验，成组资料组间比较采用独立t检验。采用Kaplan-Meier法计算生存率，差异性分析行Log-rank检验；多因素Cox回归分析影响OS及PFS的因素，以β1-AR和β2-AR蛋白表达量中位数定义其表达的高低，以患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期以及复发作为协变量，研究β2-AR和β1-AR的蛋白表达水平与OS及PFS的关系。检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 β1-AR和β2-AR在口腔鳞状细胞癌组织中的表达

β1-AR、β2-AR mRNA和蛋白在癌组织表达均高于正常口腔上皮组织（P＜0.05）；β1-AR、β2-AR 蛋白及β2-AR mRNA在癌组织的相对表达量亦高于癌旁组织（P＜0.01），见图 1～2。

图1 β1-AR和β2-AR mRNA在正常口腔上皮组织、口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达Fig.1 Expression of β1-AR and β2-AR mRNA in normal tissues,carcinoma tissues and para-carcinoma tissues

图2 β1-AR和β2-AR蛋白在正常口腔上皮组织、口腔鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达Fig.2 Expression of β1-AR and β2-AR proteins in normal tissues，carcinoma tissues and para-carcinoma tissues

2.2 β1-AR和β2-AR mRNA及蛋白表达水平与临床病理特征的关系

β1-AR和β2-AR mRNA及蛋白表达水平均与临床分期有关，其中Ⅰ～Ⅱ期患者中两者的表达水平均低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P<0.05）；β2-AR表达水平还与淋巴结转移及术后复发有关（均P<0.05）。见表1。

2.3 β1-AR和β2-AR蛋白表达水平与预后的关系

β1-AR、β2-AR蛋白表达的中位数分别为0.399、1.139，根据中位数分为对应的高表达和低表达组。β2-AR高表达组患者1年、3年总生存率分别为96.67%、86.67%，β2-AR低表达组分别为98.33%、96.67%（χ2=3.945，P=0.047），见图 3A；β2-AR 高表达组患者1年、3年无进展生存率分别为90.00%、71.67%，β2-AR低表达组分别为95.00%、91.67%（χ2=9.286，P=0.002），见图3B。β1-AR高表达组患者1年、3年总生存率分别为100.00%、91.67%，β1-AR低表达组分别为95.00%、91.67%（χ2=0.006，P=0.939），见图 3C；β1-AR高表达组患者1年、3年无进展生存率分别为91.67%、75.00%，β1-AR低表达组分别为93.33%、88.33%（χ2=3.413，P=0.065），见图 3D。多因素 Cox回归显示，控制性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期以及复发等因素后，β2-AR蛋白低表达是OS的保护因素，见表2。

图3 β1-AR和β2-AR蛋白表达与患者OS及PFS的关系Fig.3 Relationship between β1-AR and β2-AR protein expressions and patients′OS and PFS

3 讨论

越来越多证据表明与压力应激相关的儿茶酚胺类激素参与癌症的发生和发展。β-AR主要通过介导内源性儿茶酚胺作用于靶细胞，同时β肾上腺素受体磷酸化的增加在抗体快速脱敏以及下调过程也发挥重要作用，该受体还可调控转导级联效应［12］。有研究采用免疫组化检测β1-AR和β2-AR在口腔鳞状细胞癌组织样本及细胞中的表达，发现不管在癌组织或细胞中 β2-AR 均表现为过表达［13-14］。MPÉREZ-SAYÁNS等［15］通过基因芯片和RT-qPCR技术检测同样发现与β2-AR相关的ADRBK2基因呈高表达。口腔癌往往不仅涉及上皮细胞的改变，同时也涉及肿瘤微环境改变，因此本研究同时收集了癌旁组织及非口腔鳞癌患者的口腔正常黏膜上皮组织作为对照，RT-qPCR和WB检测发现与对照组织相比，β1-AR和β2-AR mRNA及蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中高表达，与上述研究结果一致，进一步证实了β1-AR和β2-AR在口腔鳞状细胞癌组织中过表达。但本研究中β1-ARmRNA表达水平与其癌旁组织无明显差异，可能是因为β1-AR在mRNA的转录水平较低而翻译效率较高从而导致在蛋白水平上的差异明显，而mRNA较蛋白质更易降解，这可能致使较小的mRNA差异无法检测出来，同时也提示β1-AR在口腔鳞癌中的特异性并不显著。

表1 β1-AR和β2-AR的mRNA及蛋白表达水平与临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between the expression levels of β1-AR and β2-AR mRNA and protein and clinicopathological characteristics

表2 影响患者OS、PFS的单因素及多因素Cox回归分析结果Tab.2 Univariable and multivariable Cox regression analysis of OS and PFS in patients

β-AR信号通路被发现与血管新生［16］、侵袭与转移［17-18］、耐药［19-20］以及肿瘤细胞干性等密切相关［21］。肿瘤的侵袭转移离不开肿瘤血管新生，新生的血管可为肿瘤不断提供养分。同时有研究表明β2-AR的活化可激活Plexin-A1-VEGFR2信号从而促进VEGF分泌进而导致胃癌血管生成［16］，此外侵袭性过氧化酶（invadopodia）与肿瘤的侵袭密切相关，可以降解细胞外基质，使肿瘤细胞实现侵袭，且β2-AR信号通路可调控侵袭性过氧化酶的形成［22］。基于本研究蛋白检测结果，并结合本课题组前期的免疫组化检测发现的β1-AR及β2-AR与口腔鳞状细胞癌患者淋巴结转移及复发密切相关［23］，本研究进一步分析其与患者临床病理特征的关系，同样发现β2-AR表达与淋巴结转移、临床分期及复发有关，随访分析也发现β2-AR低表达患者的1年、3年总生存期高于β2-AR高表达患者，多因素Cox分析结果显示β2-AR蛋白高表达是影响患者OS的危险因素，提示β2-AR高表达可作为预测口腔鳞状细胞癌患者术后复发和转移的高危因素。但是本研究中仅发现β1-AR表达水平与临床分期相关，而与术后复发和转移无关，生存随访及多因素分析亦未发现与预后的相关性，因此是否将其作为口腔鳞状细胞癌患者预后的重要指标有待进一步验证。

综上所述，本研究发现β1-AR和β2-AR在口腔鳞状细胞癌组织中存在一定过表达，但β1-AR与预后并无明显的相关性，而β2-AR与患者的术后复发和转移密切相关，β2-AR高表达的患者预后较差，β2-AR可能是口腔鳞状细胞癌患者预后预测判断的潜在指标。