尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 联合检测在糖尿病肾病中的诊断价值分析

刘敏，马芬

（河南大学第一附属医院检验科，河南 开封475000）

糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症,其特征在于肾功能的进行性恶化[1]。同时，早期生物标志物的鉴定将有助于提高疾病的诊断的准确性,阐释糖尿病肾病的发病机制。目前，尿液中的多种miRNA分子可作为疾病的特异性生物标志物[2]。miRNA 被包装在外泌体和凋亡小体中，具有高度的稳定性，使其即使脱离细胞内环境亦可抵抗RNase 的降解作用[3,4]。Nassirpour R 等人[5]通过对糖尿病肾病患者的尿液样本进行高通量miRNA-seq 测序和生物信息学分析,成功鉴定了多个差异表达的且有可能成为标志物的 miRNA, 包括 miR-133b，miR-342 和miR-30a,但该团队尚未进一步确定上述miRNA 的临床诊断价值。因此，本研究旨在探讨尿液中检测miR-342，miR-30a 和 miR-133b 对糖尿病肾病的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入 2015 年 10 月至 2018 年 10月我院收治的糖尿病肾病患者30 例，其中男性15例,女性 15 例，平均年龄 52.4±13.3 岁；糖尿病非肾病患者30 例，其中男性13 例，女性17 例，平均年龄53.2±14.2 岁。所有患者均经我院两名专家确诊。拒绝标准：⑴患有精神疾病者；⑵患有或既往患有各类恶性肿瘤者。同时，纳入2015 年10 月至2018 年10 月我院接收的健康体检志愿者，其中男性 15 例，女性 15 例，平均年龄 52.8±10.8 岁。研究开始前获得医院伦理委员会批准,入组患者和志愿者均签署知情同意书。

1.2 Real-time qPCR 采集所有受试人员中段晨尿30 mL。按照制造商说明书规范，使用TRIzol 溶液（Invitrogen）从血液中提取RNA。使用Prime Script RT Master Mix 将 500ng RNA 反向转录为 cDNAs。使用 SYBR Select Master Mix 在 ABI 7500 系统上进行qRT-PCR 实验并分析结果。使用内参基因U6 归一化，计算函数为 2-ΔΔCT，引物序列见表 1。

表1 引物序列

1.3 统计学分析 R Studio 软件进行相关分析，三组受试个体的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 指标比较采用 t 检验，用表示。应用受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）分析尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的临床诊断价值。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受试者尿液中 miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表达量比较 观察组、非肾病组和对照组尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表达量均存在显著差异（P＜0.05），见表 2。

表2 3 组人员尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的表达量

2.2 观察组与非肾病组尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 分析 为了评估miR-133 b，miR-342 和miR-30a 在观察组与非肾病组中的诊断价值，绘制 ROC 曲线,见图 1。miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲线下面积分别为 0.90±0.04 （95%CI 0.8266～0.9779）、0.79±0.07 （95%CI 0.6568～0.9143）、0.84±0.06(95%CI 0.7334～0.9577)，以miR-133b 的临界值1.338, 其诊断灵敏度为80%，特异度为90%；以miR-342 的临界值2.063，其诊断灵敏度为83%，特异度为83%；以miR-30a 的临界值2.018, 其诊断灵敏度为87%, 特异度为87%。见图 1 和表 3。

图1 观察组与非肾病组尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲线

2.3 观察组与对照组尿液中miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 分析 为了评估 miR-133b，miR-342 和miR-30a 在观察组与对照组中的诊断价值，绘制 ROC 曲线,见图 2。miR-133b，miR-342和 miR-30a 的 ROC 曲线下面积为 0.87±0.05（95%CI 0.7742 to 0.9724）、0.86±0.05 （95%CI 0.7614 to 0.9742）、0.87±0.04 （95%CI 0.7846 to 0.9709）,以miR-133b 的临界值1.077，其诊断灵敏度为83%，特异度为93%；以miR-342 的临界值1.110，其诊断灵敏度为87%，特异度为87%；以miR-30a 的临界值1.093，其诊断灵敏度为83%，特异度为87%。见图 2 和表4。

图2 观察组与对照组尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的 ROC 曲线

2.4 检测尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a对糖尿病肾病的诊断价值 患有糖尿病肾病患者样本的为真阳性（以病理结果作为参照）,未患有糖尿病肾病的为真阴性(以非肾病组为参照)。以miR-133b 的临界值 1.338、miR-342 的临界值 2.063、miR-30a 的临界值2.018 进行串联方式的联合诊断。灵敏度=真阳性个体数/（真阳性个体数+假阴性个体数）×100%，特异度=真阴性个体数/（真阴性个体数+假阳性个体数）×100%， 准确度=（真阳性个体数+真阴性个体数）/总个体数×100%。检测尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三联检测对诊断糖尿病肾病的灵敏度为77%（23/30）, 特异度为93 %（28/30），准确度为 92%（55/60）。

表3 观察组与非肾病组尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、灵敏度、特异度和截断值

表4 观察组与对照组尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的AUC、灵敏度、特异度和截断值

表5 检测尿液中miR-133b，miR-342和miR-30a 对糖尿病肾病的诊断价值

3 讨论

全球约9%的成年人罹患糖尿病[6-8],其中约40%的Ⅰ型糖尿病患者可发生糖尿病肾病，Ⅱ型糖尿病患者中亦有并发糖尿病肾病[9]。存在肾病合并症的患者面临肾功能障碍风险的概率更高,如缺血性肾病等[10]。据报道，某些miRNA 与包括肾癌和多囊肾病在内的多种肾脏疾病存在相关性[11-13]。本研究中，我们发现糖尿病肾病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和miR-30a 的三者联合检测可提高对糖尿病肾病诊断的灵敏度、特异度和准确度。

miRNA 主要发挥转录后沉默的作用, 具有高度保守、内源性，片段较短（19～25 个核苷酸）等特点[14]。多项研究旨在表征它们作为生物标志物的潜力[16]。在本研究中，糖尿病肾病患者的尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表达量均高于糖尿病非肾病患者和健康体检者（P＜0.05），糖尿病非肾病患者尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表达量高于健康体检者(P＜0.05)。据报道,miR-133b是肾肿瘤的抑制因子[17]，在多囊肾病患者中含量失调[18]。Wang 等人也发现，miR-133b-3p 在老年大鼠骨髓间充质干细胞来源的微泡中下调表达,显着抑制 HK2 细胞中 TGF-β1 介导的上皮-间质转化[19]，提示该分子可能在纤维化中发挥作用。miR-342 被证实在I 型和II 型糖尿病中均存在上调表达[20]，在患有活动性肾炎的系统性红斑狼疮患者中显着降低[21]，提示尿miR-342 的表达异常与肾病存在相关性。miR-30 家族的异常表达可致足细胞凋亡，蛋白尿肾病和肾小球硬化等[22]。尿液中miR-30a 的水平与局灶节段性肾小球硬化的活动有关,并且对类固醇治疗效果有一定提示意义[23],说明尿液中miR-30a 的表达水平是肾病预后的潜在标记物。糖尿病肾病患者和糖尿病非肾病患者的miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的灵敏度分别为 80%，83%和87%；特异度分别为90%，83%和87%；广圣芳等人[24]发现 Hcy、Cys-C、SOD 作为诊断糖尿病肾病的生物标志物时灵敏度、 特异度及准确度分别为85.3%、82.7%及84.2%。在本研究中，尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 三联检测对诊断糖尿病肾病的灵敏度为77%，特异度为93%，准确度为92%。因此,尿液中 miR-133b，miR-342 和 miR-30a联合诊断的特异度和灵敏度均高于中性粒细胞与淋巴细胞比值，显示了其较好的诊断效能。

糖尿病从发展到糖尿病肾病共历经五个阶段，第一阶段高血糖状态下，肾脏逐渐肥大，肾小球呈高滤过状态，未出现尿蛋白现象[25]。既往糖尿病肾病诊断指标中,尿蛋白从第二阶段起才可作为诊断糖尿病肾病的靶标。因此，进一步探讨尿液中miR-133b，miR-342 和 miR-30a 的表达水平与糖尿病肾病发生发展中的五个阶段的关系是下一步的研究方向。尽管miR-133b, miR-342, miR-30a的单向诊断或两两联合诊断的灵敏度均高于三者联合诊断，但是，其特异度均小于三者联合诊断。此外,单个分子可作为多种疾病的标志物,比如miR-133b 可作为急性心肌梗死的生物标志物[26], miR-342 可作为急性髓细胞白血病的生物标志物[27]，miR-30a 可作为缺血性卒中的生物标志物[28]。使用单个分子进行诊断时,如果患者患有此分子可诊断的其他疾病，就会造成大量的误诊。因此，尿液中miR-133b，miR-342, miR-30a 三者的联合诊断能够更加特异性的针对糖尿病肾病。

综上所述,尿液中miR-133b,miR-342 和miR-30a 联合检测可作为诊断糖尿病肾病的潜在标志物。