CMIA 对HBsAg 弱反应性血清标本的检测性能研究

黄韬 ，罗清 ，徐荣 ，曾文兴 ，李俊明

（1.宜春市人民医院检验科，江西 宜春 336000；2.南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330000）

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）是临床上应用最为广泛的判断HBV 感染血清学标志物之一,也是WHO 推荐的诊断HBV 感染的核心指标。目前较为主流的HBsAg 检测方法为化学发光免疫分析法（CLIA）和酶联免疫吸附测定法（ELISA）。化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）是化学发光法的一种,由于具有检测灵活、自动化程度高和更易实现检验过程的标准化等优势,CLIA 在临床上的普及率越来越高。近年来, 已有一些研究对CLIA 和ELISA 技术在检测HBV 血清学标志物方面的性能进行了比较, 研究结果均提示与ELISA 技术相比,CLIA 具有更高的检测灵敏度和更好的精密度[1-3]。然而,HBsAg 检测灵敏度的提高不可避免的会带来一些新的困扰,如少见模式结果增多、弱反应性结果、甚至部分假阳性结果的增多等,目前很少有研究探讨CLIA 和ELISA 技术检测出的弱反应性结果的可靠性。

本研究旨在评价化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）对乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）弱反应性血清标本的检测性能,以期对临床检验工作提供一定的指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有标本选自 2016 年 10 月至2018 年12 月期间在南昌大学第一附属医院就诊的患者,其中CMIA 检测HBsAg 弱反应性标本的纳入标准为：CMIA 检测浓度为 0.05～0.50IU/mL；ELI SA 检测HBsAg 弱反应性标本的纳入标准为：ELISA 检测 S/CO 为 1～4,血清标本分析前、分析中处理严格按照标准操作规程,收集到的血清标本置于-20℃保存。

1.2 仪器与试剂 CMIA 分析系统：Architect i2000微粒子化学发光免疫分析仪, 配套HBsAg 定量检测试剂盒、校准品均由雅培公司生产。ELISA 分析系统：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（ELISA)由厦门英科新创科技有限公司生产, 郑州安图DH OMO 酶标仪,DEM-3 型自动洗板机。中和确认试验检测系统：Architect i2000 微粒子化学发光免疫分析仪,配套HBsAg 定量检测试剂盒、校准品、HB-sAg 确认试剂盒均由雅培公司生产。研究过程中每批次检测均采用郑州标源生物工程股份有限公司生产的HBsAg 血清标准物质进行质量控制。

1.3 方法

1.3.1 通过检索检验信息系统中的数据 统计分析2018 年7 月至2018 年10 月在南昌大学第一附属医院门诊就诊患者 （排除感染科门诊就诊患者）CMIA 和ELISA 检测血清HBsAg 的阳性率,初步了解两种方法检测HBsAg 敏感性差异。

1.3.2 HBsAg 弱反应性血清标本的平行检测及结果确认 将筛选出的183 例CMIA 检测弱反应性标本,严格按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（ELISA)试剂说明书进行HBsAg 的检测。按照中和确认试验试剂使用说明书,对183 例弱反应性标本在Architect i2000 微粒子化学发光免疫分析仪上进行结果确认。

将筛选出的50 例ELISA 检测弱反应性标本,严格按照Architect i2000 微粒子化学发光免疫分析仪及其配套试剂的标准操作规程进行HBsAg 的检测。按照中和确认试验试剂使用说明书,对标本在Architect i2000 微粒子化学发光免疫分析仪上进行结果确认。

1.3.3 根据EP-15A2 文件[4],选择一份 HBsAg 弱反应性的临床血清标本,对该标本用CMIA 法进行连续5 天的重复检测,每天重复检测4 次,获得共20个检测结果。分析CMIA 检测弱反应性血清标本的精密度。

1.4 使用统计软件 SPSS 19.0 进行统计学分析 对CMIA 和ELISA 检测HBsAg 的阳性率差异采用卡方检验进行统计分析。

2 结果

2018 年 7 月至 2018 年 10 月期间, 南昌大学第一附属医院检验科接收申请HBsAg 检验的门诊就诊患者血清标本共计55737 例。其中采用CMIA检测标本47411 例,检测结果为有反应性血清标本9957 例,阳性率为21%；采用ELISA 检测标本8326例, 检测结果为阳性血清样本1533 例, 阳性率为18.4%。两种检测方法检测结果经卡方检验统计分析,差异具有统计学意义,P=0.032。

CMIA 检测为HBsAg 弱反应性标本的ELISA法检测结果，见表1。

183 例CMIA 检测HBsAg 结果为弱反应性的血清标本,对这些标本采用ELISA 方法进行平行检测。结果显示ELISA 检出的阳性标本数为88 例,阳性率 48.09%（88/183）。

以特异性抗体中和确认试验作为金标准对此183 例血清标本进行的确认检测结果显示, 其中168 例为HBsAg 确认阳性。CMIA 检测弱反应性HBsAg 标本的阳性预测值为91.80%。ELISA 检测弱反应性HBsAg 标本的敏感性为52.38%, 但阳性预测值达100%。

表1 183 例HBsAg 弱反应性标本各种方法结果比对

CMIA 检测值大于或等于0.16IU/mL 的标本,中和确认试验100%为阳性。

ELISA 检测为HBsAg 弱反应性标本的CMIA法检测结果。本研究纳入的50 例ELISA 检测为HBsAg 弱反应性的血清标本,对这些标本采用CMI A 检测系统进行平行检测。CMIA 的检测结果显示其中47 例为有反应性标本,3 例为非反应性标本。中和确认试验结果显示,47 例CMIA 法显示有反应性的标本HBsAg 均确认为阳性。3 例两种方法检测结果不一致的标本均为阴性。47 例HBsAg 检测结果为有反应性标本的CMIA 检测值均大于0.16 IU/mL。

根据EP-15A2 文件, CMIA 检测该弱反应性血清标本的重复性标准差Sr 和变异系数分别为0.010 和5.06%, 中间精密度标准差SI 和变异系数分别为0.011 和5.56%, 均小于厂家声称值。见表2。

表2 精密度检测结果

3 讨论

血清中HBsAg 呈现弱反应性的原因有很多种,可能与窗口期、急性感染后期、低水平携带者、慢性HBV 感染者、HBV 基因突变或变异者、 合并HCV 和 （或）HDV 感染导致的 HBV 复制和 （或）HBsAg 表达干扰等有关[5]。HBsAg 弱反应性标本的准确及时检出在提高乙型肝炎窗口期的发现率、流行病学研究、乙型肝炎的预防、保证输血安全和控制院内感染以及隐匿性乙型肝炎的诊断等方面发挥着举足轻重的作用[6-10]。

ELISA 对HBsAg 的检测是一种固相酶联免疫测定方法,在微孔条上预包被纯化的抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）,配以酶标记抗体（HBsAb-HRP）,采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中的HBsAg,通过酶与底物发生颜色反应的深浅来判读HBsAg 的水平。ELISA 是一种定性或半定量的检测方法。该方法具有检测灵敏度较高、成本低、对环境污染少等优点,但是亦存在着操作繁琐、耗时长、影响因素多、质量控制难、低浓度样本易漏检、难以定量等缺点[11]。

CMIA 对HBsAg 的检测是一种将化学发光测定技术与免疫反应相结合的定量分析方法。首先,标本和 HBsAb 包被的顺磁微粒子结合,洗涤；第二步,加入吖啶酯标记的HBsAb 的结合物,再次洗涤；最后,加入预触发液和触发液,复合物中的吖啶酯被氧化直接发光, 标本中的HBsAg 含量与光学系统所检测到的相对发光强度(RLU)呈正比。与ELI SA 相比较,该方法具有灵敏度高、可准确定量、影响因素少、重复性好、易于标准化、检测灵活、自动化程度高等优点[12]。

在本研究中, 重点对HBsAg 弱反应性标本进行分析和讨论。对183 例CMIA 检测HBsAg 呈弱反应性的标本进行ELISA 平行检测和中和确认试验检测,结果显示CMIA 检测阳性预测值91.80%；ELISA 检测敏感性52.38%,阳性预测值100%。对50 例 ELISA 检测 HBsAg 呈弱反应性标本进行CMIA 平行检测和中和确认试验检测,结果显示47例标本确认为阳性,3 例两种方法检测结果不一致的标本均为阴性。同时,精密度分析结果显示,CMIA检测弱反应性血清标本的重复性标准差Sr 和变异系数分别为0.010 和5.06%, 中间精密度标准差SI和变异系数分别为0.011 和5.56%, 均小于厂家声称值。由此可以得出,对于HBsAg 弱反应性血清标本,CMIA 不仅具有更高的敏感性,同时也具有很高的可靠性和精密度。故推荐使用CMIA 对HBsAg 弱反应性标本进行检测,避免漏诊和误诊。

对230 例CMIA 检测为HBsAg 弱反应性的标本进行分段分析的结果显示, 当HBsAg 检测值大于或等于0.16IU/mL 时, 中和确认试验100%为阳性, 检测结果的特异性达100%。因此, 我们认为CMIA 检测 HBsAg 浓度大于或等于 0.16IU/mL,假阳性存在的可能性非常小,无需确认试验即可发出HBsAg 阳性的检测报告。而当 HBsAg 浓度小于0.16IU/mL, 建议应用中和确认试验以保证结果的准确性。在本研究中,CMIA 和ELISA 同时检测HBsAg 为阳性时,确认试验阳性率 100%。因此,如果实验室条件不允许对血清标本进行中和确认试验, 建议尝试加做ELISA 检测, 检测结果若为ELI SA 同时阳性,那么可报告高度怀疑HBsAg 阳性。

HBsAg 检测有内源性和外源性两种因素影响导致假阳性的出现。ELISA 检测的内源性干扰因素包括类风湿因子（RF）、各种补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白,易嗜性抗体、某些特殊的自身抗体、外源性人抗鼠抗体以及交叉反应物质等。外源性干扰因素主要包括标本溶血、振荡的温度和时间、试剂的质量的参差不齐、细菌对血清的污染、操作过程中的清洗不彻底,标本离心不充分含有纤维蛋白丝等[13-15]。CMIA 在保证标本离心分离效果,排除严重溶血标本等外源性干扰因素后,强调接受小鼠单克隆抗体制剂诊断或治疗的患者,样本中可能出现的人抗小鼠抗体（HAMA）会严重影响检测结果。在排除以上提到的各种因素后,由中和确认试验对弱反应性标本进行确认。

未确认的标本得出的HBsAg 复检反应性结果原因有可能为非特异性反应（假反应性）。本研究中,HBsAg 和HBsAb 同时阳性的标本, 确认试验阳性率降低,也可能是非特异性反应的干扰。在HBV感染的初期或者HBV 感染后的恢复期前期, 对低水平HBsAg 的检测过程可能被血清标本中某些非特异性结合物质所干扰。建议综合评估患者HBV感染的各项指标, 包括除HBsAg 外的其他血清学标志物（例如总HBc 抗体）或者HBV DNA 等,也推荐在4～6 周后重新对HBsAg 进行测定, 以确保结果的准确性[16]。

总之,本研究对CMIA 检测HBsAg 弱反应性血清标本的性能进行了探讨,系统的分析了CMIA 检测到的弱反应性结果的符合率和精密度,对临床弱反应性结果的处理和结果审核具有一定的参考价值。