染色体微阵列分析技术在112例血清学筛查高风险孕妇中的应用

宋花蕾 魏学功 张风琴 刘玉芳 黄俊芝 李友瑞

1 滨州医学院附属医院妇产科 山东 滨州 256603；2 滨州医学院附属医院超声医学科 山东 滨州 256603；3滨州医学院附属医院 山东 滨州 256603

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis, CMA) 技术是一项新型的染色体分析技术，能够检测出大于100 Kb 的拷贝数变异 (copy number variation, CNV)微缺失/微重复，故而被称为分子核型[1]。相比传统核型分析，CMA具有更好的分辨率、更高的自动化程度和更快的检测周期，弥补了染色体核型分析的不足，近年来越来越广泛地应用于产前诊断领域[1]。该项技术已被推荐为一线产前诊断技术应用于存在超声结构异常的胎儿中[2-3]。2016年，美国妇产科医师学会(ACOG )与母胎医学会(SMFM)联合发表指南指出在胎儿超声及染色体核型分析正常的群体中，CMA可以检出约1.7%患者具有致病性或可致病性拷贝数变异，因此CMA可应用于所有接受有创产前诊断的孕妇[4]。本研究对112例中孕期血清学筛查高风险孕妇的羊水标本进行染色体核型分析与染色体微阵列分析，探讨染色体微阵列分析技术在血清学筛查高风险孕妇中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2018年7月—2019年8月在滨州医学院附属医院产前诊断门诊就诊的112例中孕期血清学筛查高风险(不包含神经管缺陷高风险)的单胎孕妇作为研究对象。所有参与本研究的孕妇在研究前对本次实验目的及过程均有充分的了解，表示自愿参与本次研究,并签署知情同意书, 同意进行羊膜腔穿刺。本研究符合医学伦理学要求并经伦理委员会审批通过。上述112例血清学筛查高风险孕妇均排除了超声结构异常，同时胎儿颈后透明带厚度(NT)均小于3.0 mm。

1.2 研究方法

1.2.1 胎儿羊水标本采集 羊膜腔穿刺术孕周在18～24周；112例孕妇接受B超引导下经腹羊膜腔穿刺术，抽取羊水30 mL，其中20 mL分析染色体核型，另10 mL行CMA检查。

1.2.2 染色体G显带核型分析 抽取羊水20 mL，按常规操作进行培养、收获、制片和胰酶显带，染色体长度400～550分带水平，按照人类细胞遗传学国际命名体制 (ISCN2013) 标准进行核型分析诊断。

1.2.3 染色体微阵列芯片分析 抽取羊水10 mL送检。使用Affymetrix公司的CytoSean750k 芯片，参照 Infinium HD Assay 标准操作流程进行扩增、杂交、扫描和分析，5 d后得到结果，结果判读参照DCV、ISCA、OMIM、ECIPHER等数据库。根据美国遗传协会推荐的分类标准[5]分为三大类(5级)：良性CNV、致病性CNV、临床意义不明性CNV(包括可能良性、可能致病性、不确定性)，进行临床判定。

1.2.4 标本常规进行短串联重复序列(short tandem repeat，STR) 进行母血污染鉴定。

1.3 统计学方法 所有数据均为计数资料，用频数或百分率表示。

2 结果

2.1 传统染色体核型分析和CMA技术在检查染色体非整倍体异常的结果分析 112例血清学筛查高风险孕妇的胎儿，羊水细胞培养成功率为100%；本研究中检出胎儿非整倍体异常者3例，均为标准型21三体综合征；CMA检测结果与染色体G显带核型分析结果一致，非整倍体检出率为2.67%。

2.2 胎儿染色体核型结果正常但CMA检测发现致病性CNVs的结果及妊娠结局 112例血清学筛查高风险孕妇的胎儿，通过CMA额外发现4例致病性CNVs(表1)，包括1 例22q11微重复综合征、1例1p31微缺失综合征及2例单基因病(假性肥大型肌营养不良及X连锁鱼鳞病各1例),致病性CNVs检出率为3.57%(4/112)。检出4例致病性CNVs的孕妇，病例1和病例2继续妊娠至足月分娩，随访至出生后8个月生长发育正常；病例3和病例4选择终止妊娠。

表1 检出致病性(含可能致病性)CNVs的4例胎儿的CMA结果及妊娠结局

2.3 本研究临床意义不明性CNV的检测结果分析 112例血清学筛查高风险孕妇的胎儿中，CMA检出3例临床意义未明的CNVs， VOUS结果检出率为2.68%(3/112)。3例检出VOUS的胎儿(详见表2)，其中1例来源于临床表型正常父亲，考虑为良性拷贝数变异。随访发现3例均活产，其中病例5和病例6随访至出生后6月生长发育正常；病例7胎儿随访至出生后2月生长发育正常。

表2 检出VOUS的3例胎儿的CMA结果及妊娠结局

3 讨论

唐氏筛查高风险孕妇一般建议羊膜腔穿刺，抽取少量羊水细胞进行体外细胞培养，羊水细胞培养染色体核型分析也被认为是染色体异常产前诊断的金标准。然而，传统染色体核型分析技术只能检测出大于5～10 Mb的染色体片段异常，无法发现染色体微小片段(小于3～5 Mb)的缺失及重复[6]。目前，随着产前诊断技术的发展及对染色体疾病谱了解的不断深入，许多染色体微结构异常被检出，尽管每种类型发病率很低，但人群累计总体发病率较高[7]。基于这种考虑，本研究对血清学筛查高风险孕妇，同时行羊水核型分析及CMA检查。结果显示，在血清学筛查高风险人群中，传统染色体核型分析技术可以检出2.67%(3/112)的染色体异常，主要为染色体非整倍体异常。而CMA技术除了检查出上述非整倍体异常外，还发现了4例具有临床意义的CNV，额外诊断率为3.57%，包括1例微重复综合征，1例微缺失综合征以及2例单基因遗传病。

病例1胎儿X染色体p22.31缺失724kb(拷贝数为0)，缺失片段包含STS基因，该基因被认为是导致X连锁鱼鳞病的关键基因，其编码类固醇硫酸酯酶[8-9]。STS 基因完全缺失会造成类固醇硫酸酯酶缺乏症，使胆固醇硫酸盐在表皮中的含量减少，继而皮肤中的游离胆固醇减少，导致角质形成细胞结合紧密，影响正常皮肤的脱落形成鳞屑，表现为鱼鳞癣样皮肤异常、眼部异常等。有研究发现类固醇硫酸酯酶缺乏可引起雌三醇生物合成异常，导致极低的母体血清uE3水平[10]，而uE3水平的异常可引起血清学筛查高风险。本例胎儿为男性胎儿，存在STS基因缺失，通过对孕妇家族史追问发现，孕妇弟弟及其舅舅四肢等部位均存在鳞屑情况，诊断为 X-连锁遗传性鱼鳞病成立。因孕妇既往多囊卵巢病史，此次妊娠胎儿珍贵，详细告知病情后，孕妇及家属选择继续妊娠。现胎儿出生后8月余，随访发现仅下肢存在少许鱼鳞样表现，生长发育良好。

病例2胎儿22号染色体q11.21重复2.5Mb，重复区域覆盖22q11重复综合征致病区域，该变异遗传自表型正常的母亲，但该变异临床表现呈现高度异质性，且症状严重程度个体差异较大，可从无症状到严重畸形，严重者可表现为生长发育迟缓、先天性心脏病、学习困难、语言发育障碍等[11-12]。该例孕妇表型正常，孕期超声未提示结构异常，孕妇及家属选择保留此胎儿。现出生后9月余，随访至今发育正常。

病例3胎儿X染色体p21.1存在309kb 片段缺失(拷贝数为0)，该缺失片段包含了DMD基因，该基因的缺失可导致杜氏假性肥大型肌营养不良。该病为X连锁隐性遗传，男性发病，以进行性加重的对称性肌无力、肌萎缩、血清肌酸激酶水平增高和小腿腓肠肌假性肥大为主要特征。杜氏型肌营养不良症患儿通常于2～4岁表现出双下肢运动乏力，呈进行性加重，12岁前丧失行走能力，20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭[13]。目前对于杜氏假性肥大型肌营养不良尚无有效的治疗手段，将病情详细告知孕妇及家属后，患者要求终止妊娠。因本病为X连锁隐性遗传，建议孕妇及其女性家系成员进行DMD基因携带者的诊断，为再次妊娠行产前诊断提供依据。

病例4胎儿1号染色体p31.2处存在3.2Mb缺失(拷贝数为1)，包含DNAJC6(608375)，LEPR(601007)，MIER1(616848)，SLC35D1(610804),PDE4B(600127),IL23R(607562)等共23个基因。1p32p31微缺失综合征是一种罕见的缺失综合征，缺失片段大小从120kb至22.0Mb不等，临床表型多样，包括头部异常(巨头畸形、脑积水)、肾脏异常、膀胱异常、中枢神经系统异常以及张力减退等。该病例与1p32p31微缺失综合征存在部分重叠，参考DCV、ISCA、OMIM、ECIPHER等数据库，发现其中有一篇报道发现缺失区域与本病例相似，主要临床表现为轻度智力低下，面部畸形以及精神疾病[15]。综合考虑为可能致病性变异。对胎儿父母进行外周血染色体核型分析及CMA，结果未见异常。虽然该例胎儿行系统彩超未见异常，经充分遗传咨询后，孕妇及家属选择终止妊娠，但拒绝尸体解剖。

本研究中检出临床意义不明的拷贝数变异(VOUS)3例，其中病例5胎儿的拷贝数变异确诊为父源性，胎儿父亲临床表型正常，因而考虑为良性CNVs。查询公共数据库、正常人数据库及现有文献，病例6胎儿的拷贝数变异均无相关疾病报道，因而考虑为临床意义不明性CNVs。在病例7胎儿中，CMA检测未发现微缺失微重复，检出22q12.3q13.3区域存在15.8 Mb纯合片段，彩超未见异常，因而考虑其为临床意义不明性CNVs。

综上所述，在血清学筛查高风险的孕妇，CMA可检出传统核型分析无法识别的染色体微缺失/微重复综合征，甚至可检出因基因缺失所致的单基因病,具有良好的临床应用价值。因而对于血清学筛查高风险且接受产前诊断的孕妇，充分告知后，可为其提供CMA检测技术平台，使其获取最准确、全面的信息，从而减少出生缺陷的发生。