薄层色谱法检测大豆皂苷的条件优化
2021-01-18范姝姝徐海军杜维俊赵晋忠岳爱琴
范姝姝 ，徐海军 ，杜维俊 ，赵晋忠 ，岳爱琴
（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西农业大学基础部，山西太谷030801）
大豆皂苷是大豆中重要的次生代谢产物之一，具有多种对人体有益的生物活性，如抗癌[1-2]、抗病毒[3]、抗血脂[4]，对人结肠癌细胞的抗增殖作用[5-6]，以及通过分泌甲状腺激素减少肝脏脂质过氧化[7]。其主要分布在大豆种子中，含量为0.6%～6.2%[8]。大豆皂苷属于五环三萜类齐墩果酸型，由非极性的三萜苷元大豆皂醇A、皂醇B 和β-D- 葡萄糖、β-D-半乳糖、β-D- 木糖、β-D- 葡萄糖醛酸、α-L- 鼠李糖、α-L- 阿拉伯糖6 种糖基及其乙酰化糖基等组成[9-10]。根据苷元不同可将大豆皂苷分为A 类、B 类、DDMP 类、E 类[11-12]。A 类皂苷是大豆皂醇 A 的 C-3和C-22 位上结合了2 个糖基链。目前，A 类皂苷根据 C-22 糖苷的不同分为 3 个系列：Aa 系列（Aa、Au、Ae、Ax、Ay、Ag）、Ab 系列（Ab、Ac、Af、Ad、Az、Ah）和 A0 系列（A0-αg、A0-βg、A0-γg、A0-αa、A0-βa、A0- γa）[13-15]。
目前，对大豆皂苷定性分析的方法有薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）[16]、高效液相色谱法[17-18]等。HU 等[19]利用高效液相色谱法检测已知大豆皂苷组分，但此方法需要昂贵的仪器。TLC 法是一种定性分析少量物质的一种主要的实验技术，该方法是根据不同的分析物质与固定相、流动相的亲和性不同，从而具有不同的迁移率进行分离[20]。TLC 可以同时分析多个样品，且不需要复杂的仪器，分析成本低，方法简单，结果可直接观察[21]。但采用的薄层色谱法检测大豆皂苷存在边缘效应，比如谱带丢失或拖尾现象，尤其是谱图中低聚糖区与皂苷区相互干扰。因此，对现有TLC 法进行优化，以确保其检测的准确性。
本研究主要通过对TLC 法展开剂配比、展开时间、点样量、展开温度、预饱和时间以及显色条件进行优化，建立一种TLC 法快速检测大豆皂苷的方法，并对20 个大豆材料皂苷类型进行分析，旨在为今后大豆皂苷特异种质的筛选和改良提供技术基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试大豆材料均由山西农业大学大豆育种室提供（表 1）。
表1 供试大豆材料名称和皂苷类型
大豆皂苷标准品 Aa（≥98%，HPLC）、Ab（≥98%，HPLC）、Ba（≥98%，HPLC）、Bb（≥98%，HPLC）购于成都曼思特生物科技有限公司。
1.2 试剂与仪器
甲醇、氯仿、乙醇、冰乙酸、甲酸、石油醚（沸程为60～90 ℃）均为分析纯，购于天津市永大化学试剂有限公司。GF-254 硅胶板，购于青岛裕民源硅胶试剂厂。
震动研磨仪（北京格瑞曼仪器设备有限公司）、移液枪（广州市昕迪实验器材有限公司）、电子天平（深圳市铭科科技有限公司）、数显恒温水箱（金坛市新航仪器厂）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品的制备 将大豆胚、子叶、种皮、茎、叶、根冷冻干燥，球磨仪磨成粉末，过0.42 mm 筛备用。
胚、子叶、根、茎、叶置于含0.01%乙酸的70%乙醇水溶液中室温浸提24 h，离心取上清，用2 倍体积的石油醚萃取脱脂，4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 标准溶液的制备 准确称取大豆皂苷标准品 Aa、Ab、Ba、Bb 各 1 mg，分别溶于 1 mL 甲醇，配成1 mg/mL 标准溶液，4 ℃保存备用。
1.3.3 薄层色谱条件的优化
1.3.3.1 展开剂的优化 在其他条件不变的情况下，通过改变展开剂配比（表2）考察了4 种展开剂对反应结果的影响。
表2 大豆皂苷展开剂配比
1.3.3.2 展开时间的优化 在其他条件不变的情况下，通过改变展开时间考察了4 个展开时间（30、50、70、90 min）对反应结果的影响。
1.3.3.3 点样量的优化 在其他条件不变的情况下，通过改变胚提取液的点样量考察了7 个点样量（2、4、6、8、10、12、14 μL）对反应结果的影响。
1.3.3.4 展开温度的优化 采用优化后的点样量和展开剂条件下，通过改变展开温度考察了4 个温度（20、25、30、35 ℃）对反应结果的影响。
1.3.3.5 预饱和时间的优化 采用优化后的薄层色谱条件，通过改变预饱和时间考察了4 个预饱和时间（0、30、60、90 min）对结果的影响。
1.3.3.6 显色条件的优化 采用优化后的薄层色谱条件，通过改变显色时间考察了4 个TLC 板在10%的 H2SO4溶液中浸泡时间（0、3、5、8 min）对显色结果的影响。
1.3.4 验证优化后的TLC 法 检测大豆皂苷的准确性和适用性，并对20 种不同大豆材料胚的大豆皂苷提取液进行分析。
2 结果与分析
2.1 展开剂和展开时间的优化分析
由图1 可知，4 种展开剂均可以将异黄酮、皂苷和低聚糖分离。已知展开剂、展开剂1、展开剂3 的大豆皂苷条带均有拖尾现象，分离效果差；而展开剂2 可以得到清晰的皂苷条带，分离效果较好，因此，选择展开剂2 为TLC 最佳展开剂。
从图 1 可以看出，展开时间为 30、50 min 时，大豆皂苷谱带分离效果不好；展开时间为70 min 时，各组分谱带分离明显，且无谱带丢失现象；展开时间为90 min 时，微量组分谱带模糊，所以，展开时间70 min 为TLC 法检测大豆皂苷最佳展开时间。
2.2 点样量的优化分析
从图2-A 可以看出，子叶提取液点样量为2、4、6、8 μL 时，含量少的谱带不显色；点样量为 10 μL时，分离度效果好，可以观察到所有谱带。由图2-B可知，胚提取液点样量为2、6 μL 时，弱带不显色；点样量12、14 μL 时产生拖尾，各条带变宽而发生重合，所以，子叶和胚点样量均为10 μL 是最佳点样量。
2.3 展开温度的优化分析
由图3 可知，展开温度为20、25 ℃时，迁移距离小，谱带分不开；展开温度为30 ℃时，谱带能较好地分离，且色谱图重复性好；展开温度为35 ℃时，谱带迁移距离相对较大，且色谱图不稳定。所以，最佳展开温度选择30 ℃。
2.4 预饱和时间的优化分析
从图4 可以看出，显色前如果不进行预饱和，TLC 板会产生边缘效应；预饱和时间为30 min 时，无边缘效应，且皂苷各组分谱带清晰；延长预饱和时间为60、90 min 时，谱带模糊。所以，预饱和时间30 min 为最佳预饱和时间。
2.5 显色条件的优化分析
从图5 可以看出，TLC 板未经10%的H2SO4显色溶液浸泡时，由于低聚糖谱带颜色深且紧邻皂苷谱带，对皂苷显色产生干扰；显色液中浸泡3 min 时低聚糖颜色变浅，且得到清晰的皂苷谱带；浸泡5、8 min 时，因显色时间过长，皂苷谱带颜色变浅，含量少的皂苷谱带不显色。所以，选择10%的H2SO4溶液中浸泡3 min 为最佳显色条件。
2.6 TLC 法检测大豆皂苷的准确性分析
从图6 可以看出，4 种大豆皂苷标准品和3 个样品均有较好的分离效果，且谱带清晰。样品谱带与标准品谱带进行对照，可以确定大豆材料皂苷的类型。
2.7 检测大豆皂苷适用性分析
利用优化的TLC 法对20 个大豆材料进行大豆皂苷组成分析，结果表明（图7），第一泳道晋大53和第8 泳道SNWS47 皂苷类型属于Ab 型皂苷，其他大豆材料均属于Aa 型。第4 泳道晋豆19 有2 条谱带，而其他材料至少有3 条谱，表明不同大豆材料胚中所含的大豆皂苷组分存在差异。
3 结论与讨论
张倩等[22]建立了TLC 法检测野生大豆皂苷展开体系，但其展开过程必须在10 ℃以下完成，否则会影响分离效果。本研究对TLC 检测大豆皂苷的展开剂配比、展开时间、点样量、展开温度、预饱和时间以及显色条件进行了优化，结果表明，展开剂为氯仿∶甲醇∶水∶甲酸＝65∶38∶10∶0.01（V/V），展开时间 70 min，点样量 10 μL，展开温度 30 ℃，预孢和时间30 min，在10%的H2SO4溶液中浸泡3 min为最优条件。为了验证优化后的TLC 法检测大豆皂苷的准确性和适用性，对大豆皂苷标准品和20 个大豆材料皂苷类型进行了分析，证明该优化体系可以快速、准确地检测大豆皂苷类型。该方法可用于快速检测大豆种质资源皂苷类型。
