仿生识别传感器的制备及其在抗生素检测中的应用

张磊，邓健康，张富源

（1.天津科技大学食品科学与工程学院食品营养与安全国家重点实验室，天津300457；2.河南科技学院食品学院，河南新乡453003；3.衡水学院生命科学学院，河北衡水053000；4.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001）

动物源性食品，比如肉、蛋和奶等，作为磷和蛋白质的主要来源，是人们日常饮食中的重要组成部分[1]。众所周知，抗生素作为一大类用于治疗和预防细菌感染、促进动物生长的天然产生或人工合成的化学物质，在畜牧业中被广泛使用。然而，抗生素在畜牧业中的不当使用以及普遍存在的预防性添加现象，导致动物源性食品中可能存在抗生素残留问题。这一方面会引起细菌耐药性的增加，另一方面又会造成动物源性食品安全问题，进而对人体健康造成威胁[2]。更为甚者，随着进出口产品的大规模生产以及全球化的推动，抗生素耐药性及其污染正快速成为全世界普遍关注的焦点问题[3]。为降低细菌耐药性的危害，除了禁止使用一些抗微生物生长促进剂以外，欧盟和美国等国家和地区还对可用抗生素制定了最大残留限量（maximum residue levels，MRLs），以确保消费者的饮食安全。我国于2019 年颁布了最新的食品中兽药残留的国家标准GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》[4]，其中详细规定了在动物源性食品中抗生素最大残留限量标准以及不得检出的抗生素种类，是我国现行的食品中抗生素的MRLs 标准。动物源性食品中抗生素残留具有基质复杂和痕量存在的特点。因此，开发具有简单快速、灵敏度高和可靠性强等优点的检测手段，对动物源性食品中的抗生素残留加以限制，具有非常重要的研究价值和现实意义，是保证动物源性食品安全的有效途径。

目前，用于抗生素残留检测的常规方法包括微生物法、色谱法和免疫法。微生物法主要是基于抗生素对细菌的抑制作用，包括试管测试、平板测试等。这些方法成本低，但耗时、不准确，并且对某些抗生素还不够敏感。色谱法是目前最常规的经典分析方法，包括高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC），气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）以及薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）等。这些方法具有很高的灵敏度和选择性，但也存在样品预处理复杂、需要精密大型仪器和专业测试人员等缺陷，限制了它们在现场检测中的应用[5]。免疫方法是一种基于互补抗体作为选择性试剂的分析方法，包括酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）、电化学免疫分析（electro chemiluminescence immunoassay，ECI）和胶体金免疫层析法（gold immuno-chromatographic assay，GICA），具有快速、灵敏、准确以及高选择性等优点，已被广泛用于抗生素的高通量快速检测，但也存在抗体制备复杂困难、难以保存以及动物伦理问题等不足[6]。

近年来，生物传感器的开发引起了研究者们极大的兴趣。与传统方法相比，其主要优势在于方法简单、成本低、灵敏度高以及特异性强等，可对样品进行原位和实时检测。20 世纪80 年代，生物传感器逐渐开始应用于食品安全领域[7]。近年来，随着各种仿生分子识别技术的成功开发，研究者们制备了大量具有高度选择性和适用性的新型生物传感器，使其逐渐成为食品安全以及其他许多分析领域中简单、快速和低成本检测抗生素的重要手段[8-9]。但是，现有的生物传感器方法还需要在诸如灵敏度、特异性、便携性、低成本、高通量以及商业化上不断改进，以满足广大群众对抗生素日常检测的迫切需求。所以，基于上述原因，非常有必要对生物传感器在抗生素残留检测方面的最新研究进行全面综述，以利于研究者们下一步的工作。

本文对近几年来用于抗生素检测的常见生物传感器进行了分类综述，其中着重分析了主要仿生受体和换能器的基本原理及其优缺点，以及它们在抗生素残留检测中的应用。最后，还对仿生识别手段的发展前景进行了展望。

1生物传感器

生物传感器是一种能将生物响应转换为电信号的分析设备，它主要由两部分组成：识别元件和换能器。其中，识别元件负责特异性识别与结合目标分析物，换能器负责将分析物结合或转换时产生的化学信号转换成易于量化的输出信号[10]。它可以实现分析仪器的小型化，并表现出与传统分析技术相当的灵敏度和选择性。这在食品安全检测中非常必要。

1.1 识别元件

1.1.1 生物受体

生物传感器中传统的识别元件主要是一些具有分子识别能力的生物分子，包括：抗体、酶、核酸、细胞以及基于它们的半合成受体等。

抗体是最为常用的生物受体，其优点主要在于它们的高度敏感性和特异性。然而，其固有的一些缺陷，比如：稳定性差、成本高、动物伦理问题以及非特异性结合等，限制了它们在食品安全检测领域的应用。酶生物传感器可测量特定目标物对酶的选择性抑制或催化作用，也被用于检测食品和环境样品中的一些污染物，但多集中于对除草剂的分析，而关于抗生素检测的报道很少[11]。核酸（DNA 和RNA）作为识别元件，在化学性质上比抗体更为稳定。在核酸传感器中，DNA（或RNA）识别元件与靶DNA（或RNA）序列的特定区域能通过碱基配对形成探针-靶标复合物，最终实现识别元件对目标物的特异性识别[12]。细胞生物传感器能满足多种分析物高通量同时检测的需要。然而，它存在费时、耐用性差以及样品基质成分的非特异性吸附等问题[13]。另外，基于常用的天然生物受体，研究者们还尝试开发了多种半合成生物受体，比如：重组抗体[14]、噬菌体展示抗体库[15]和亲和体[16]等。

生物受体以及半合成生物受体因其优异的特异性识别能力，在许多领域中被广泛应用。但是，它们存在制备困难、成本高以及稳定性差等固有缺陷，这极大地限制了它们在食品安全分析领域中的应用。

1.1.2 仿生识别元件

近年来，仿生识别（biomimetic recognition）元件作为生物受体的有效替代品，因其相对于生物受体的诸多优势，引起了研究者们极大的兴趣。与生物受体相比，仿生识别元件可通过体外制备的方法来合成，这不仅有效避免了生物受体对实验动物的繁琐工作，而且还能减少识别元件的批次间差异性。更为重要的是，制备的仿生识别元件具有识别非免疫原性分子的能力，使其更适合于小分子目标物的检测。近年来，研究者们通过将分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）和核酸适配体（aptamers）等仿生识别手段引入到生物传感器中，利用它们易制备、低成本的优点，以及恶劣环境条件下（例如：酸或碱条件、有机溶剂，或高温高压等）的高稳定性和可重复性，有效地拓宽了生物传感器在食品安全分析领域中的应用。

1.1.2.1 MIPs

分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）是一种重要的仿生分子识别技术。它是基于“抗原-抗体”学说建立的一种可与目标物高选择性结合的极为有效的方法。该技术通过化学交联反应将模板分子与功能单体合成稳定的MIPs，在除去目标分子以后，聚合物中保留了具有特定形状、结构和官能团的互补空腔，它们可以高选择性地识别目标物及其类似物[17]。与天然抗体相比，MIPs 具有稳定性强、对苛刻条件（例如：不同溶剂）的耐受性强、制备方法简单、成本低、可重复使用以及目标物通用性强（例如：抗生素和农药等）等优势。所以，它非常适合于构建各种生物传感器，并且表现出准确、高效、灵敏度高且生物相容性好等特点[18]。

1.1.2.2 aptamers

aptamers 作为一种单链DNA 或RNA 寡核苷酸，可以特异性结合多种不同类别的靶分子，包括：小分子（比如：核苷酸、氨基酸、金属离子和其他小分子）、大分子（比如：肽、多糖和蛋白质），以及各种复杂结构（比如：完整细胞、病毒和单细胞生物）等，具有低分子量、易修饰、合成简单、稳定性好、高亲和力、高稳定性、高选择性和高敏感性等优点[19]。

与抗体相比，适配体的优势主要为：（1）化学稳定性高，对pH 值的变化不敏感，可在环境温度下长期保存；（2）变性高度可逆，可在高温下变性并在低温下复性；（3）合成简单，可在体外进行非生物筛选并以高纯度合成；（4）可识别多种靶标，包括小分子、大分子以及各种复杂结构等；（5）具有高度亲和力，对目标物的解离常数（Kd）在10-6mol/L～10-12mol/L 之间；（6）易于修饰并且适合与纳米材料组合。基于以上优点，aptamers作为抗体的有效替代者被广泛应用于生物医学、生物分析等领域[20]。

1.2 换能器

根据换能器的不同，生物传感器可分为：光学、电化学、质量敏感以及其他生物传感器等。其中，尤以光学和电化学生物传感器在食品分析中应用最为广泛。

1.2.1 光学

光学检测可捕获由识别元件与目标分析物相互作用产生的信号，并将其转换为光信号。近年来，光学生物传感器由于其操作简便、响应速度快和灵敏度高等优点而被广泛用于抗生素检测。1995 年，Sternesjo等[21]首次制备了基于表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）的高灵敏度生物传感器用于抗生素检测，这为抗生素的光学免疫测定奠定了基础。随着荧光纳米材料的发展，其在荧光传感器中的应用越来越多。2006 年，Ding 等[22]第一次采用基于量子点（semiçonductor quantum dots，QDs）的荧光免疫分析法进行抗生素检测。另外，Tan 等[23]设计一种基于氧化石墨烯（graphene oxide，GO）水凝胶的荧光分析方法用于土霉素（oxytetracycline，OTC）检测。

1.2.2 电化学

电化学检测是基于化学反应引起的电子或离子测量值变化，从而导致溶液电参数变化的原理。它具有高灵敏度、高选择性、低成本和易于操作等优点[24]。电化学生物传感器主要分为四类：电流型、阻抗型、伏安型和光电化学型。近年来，许多纳米材料已被整合到电化学传感器中，以改善其检测性能。例如，Gonçalves 等[25]利用半胱氨酸自组装单层膜将青霉素酶固定在金电极上，制备了一种电流型电化学传感器用于青霉素G（benzylpenicillin，penicillin G）的检测。Liu 等[26]提出一种的基于金电极修饰的羧基-Fe3O4磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNPs）的阻抗型电化学免疫传感器，用于四环素（tetracycline，TC）的检测。Zhou 等[27]构建了一种多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）修饰的基于循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）和微分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）的电化学传感器，用于TC 检测。Li 等[28]提出了一种水分散性类石墨氮化碳（waterdispersible graphite-like carbon nitride，w-g-C3N4）作为光敏材料的光电化学（photoelectrochemical，PEC）适配体传感器，用于特异性检测卡那霉素（kanamycin，KAN）。

1.2.3 其他换能器

近年来，表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）由于其具有简单、快速、高灵敏度以及无需样品预处理等优点，被广泛用于构建生物传感器。例如，Yang 等[29]提出了一种基于竞争性免疫测定和磁分离的SERS 生物传感器，用于氯霉素（chloramphenicol，CAP）的检测。另外，研究者们还制备出基于质量敏感检测的压电生物传感器，用于抗生素的现场实时检测。例如，Karaseva 等[30]提出了一种基于MIPs 的压电生物传感器，用于检测青霉素G。

2 仿生生物传感器在抗生素检测中的应用

2.1 基于MIPs 的仿生生物传感器

近年来，MIPs 因其快速、准确和成本低的特点，并具有能有效分离复杂样品组分、选择性识别目标物并进行富集、简化前处理过程以及降低检出限等优点，其在食品安全分析检测中的应用越来越多。Jia 等[31]以4-硝基甲苯（4-nitrotoluene，NT）为虚拟模板，合成了对CAP 具有高度特异性的MIPs，通过化学发光的方法测定肉中的CAP 含量，其检出限（limit of detection，LOD）低至5.0 pg/g。Jiang 等[32]以米诺环素（minocycline）为模板，以双（2，4，6-三氯苯基）草酸酯-过氧化氢-咪唑[bis（2，4，6-trichlorophenyl）oxalate-hydrogen peroxideimidazole]化学发光体系启动光信号，制备了用于检测5 种四环素类抗生素的化学发光传感器，表现出简单、快速、灵敏及可重复性的优点。Long 等[33]基于磁性MWCNTs，构建了一种磁性印迹电化学传感器，用于复杂基质样品中痕量KAN 的灵敏测定。Song 等[34]使用电聚合MIPs 修饰的Au-Ag 合金微棒（alloy microrod，AMR）作为工作电极，对甲硝唑（metronidazole，MNZ）进行超灵敏的电化学检测，表现出很好的特异性和抗干扰能力。另外，Ebarvia 等[35]提出了一种基于MIPs 和压电石英晶体的传感器，成功用于牛奶、蜂蜜和虾等食品中CAP 的检测。

2.2 基于适配体的仿生生物传感器

通常，适配体与不同载体结合，可构建复合探针和电化学传感器。前者用aptamers 和微载体（如QDs、CDs 和AuNPs）制备，具有易于制备、方法检出限（limit of detection，LOD）低（可低至nmol/L 水平）等优点；后者由适配体和电化学电极制成，这种方法通常制备过程很耗时，但是检测限更低（可降至pmol/L 甚至fmol/L水平）。

近年来，已开发出一些“适配体传感器”来检测动物源性食品中的抗生素残留，例如：CAP、TC、KAN、链霉素（streptomycin，STR）、氨苄西林（ampicillin，AMP）以及磺胺二甲氧嘧啶（sulfamethazine，SMZ）等。Javidi等[36]采用完整的长序列aptamer 作为识别元件，短序列寡核苷酸作为与适配体末端片段互补的锁定探针（locker probe，LP），构建了基于AuNPs 的比色适配体传感器，用于牛奶中CAP 的检测。结果显示，该方法表现出简单、灵敏且优异选择性等优点。Ouyang 等[37]开发了一种基于aptamers 的上转换纳米聚粒（NaY0.48Gd0.3F4：Yb0.2，Ho0.02）生物传感器，成功用于牛奶、猪肉等实际样品中TC 的检测。He 等[38]开发了一种由氧化石墨烯量子点（graphene oxide quantum dots，GOQDs）标记的aptamers 作为荧光供体，GO 作为淬灭剂的荧光“开/关”传感器，用于牛奶样品中SMZ 的检测。Qin 等[39]基于硫氨酸官能化石墨烯（thionine functionalized graphene，GR-TH）和分层纳米孔（hierarchical nanoporous，HNP）PtCu 合金作为生物传感基质构建了一种新型电化学适配体传感器，用于动物源性食品（猪肉和鸡肝）中KAN 的检测。Xu 等[40]通过一锅法合成了一种新型的CdTe 量子点-单壁碳纳米角（CdTe quantum dots-single walled carbon nanohorns，CdTe-SWCNHs）纳米复合材料，以其作为光敏材料、适配体作为识别元件，构建了PEC 适配体传感器，并成功用于蜂蜜样品中STR 的检测。Wang 等[41]构建了一种基于DNA 适配体功能化的AuNPs 和单链DNA 结合蛋白（single-stranded DNA binding protein，ssDNA-BP）的电化学传感器，成功用于牛奶等实际样品中AMP 的检测。

3 新型仿生识别手段及其发展前景

3.1 新型仿生识别手段

近年来，基于识别元件在生物传感器中的重要地位，研究者们开发了多种新型仿生识别受体，以满足对生物传感器快速诊断和改善检测性能（包括：选择性、稳定性以及成本效益等）的要求。

1）序列优化适配体（sequence-optimized aptamers）。通过优化适配体序列，使适配体-目标物的识别引起更大的构象变化，以提高检测体系的灵敏度。例如，Schoukroun-Barnes 等[42]通过改进电化学转导信号和适配体序列突变用于氨基糖苷类抗生素的检测，结果显示检测限降低了100 倍。

2）催化性MIPs（catalytic MIPs）。MIPs 既作为识别元件，又作为检测化学信号的酶。例如，Gu 等[43]以三聚氰胺为功能单体和模拟酶成分，成功合成了具有类似硝基还原酶活性的MNZ 印迹聚合物。

3）脂质体（liposomes）。脂质体通过与聚二乙炔（polydiacetylenes，PDA）表面偶联，可用于氨基糖苷类抗生素的检测。例如，Kang 等[44]模仿新霉素（neomycin）和磷脂之间细胞膜相互作用的机制，构建了脂质体与PDA 表面偶联的生物传感器，成功用于氨基糖苷类抗生素的检测。

4）纳米酶（nanozyme）。纳米酶[45-46]不仅具有与天然生物酶相仿的催化活性，而且比后者更强大、更稳定，且成本更低。例如，Sharma 等[46]结合AuNPs 固有的过氧化物酶活性与aptamers 的高亲和力和特异性，构建了一种新型荧光“关/开”生物传感器，可有效用于KAN 的检测。

3.2 发展前景

仿生识别受体具有易制备、低成本、高稳定性和可重复性等优点，它能满足未来对生物传感器小型化、高通量以及现场检测的潜在要求[47]。因此，随着生物传感器在食品安全领域中的应用日益广泛，系统研究基于仿生识别的生物传感器显得尤为重要。

目前，除了开发新型仿生识别受体以外，针对仿生识别受体的研究主要集中于以下几个方面：

1）仿生识别受体组合。通过将多种仿生识别受体组合使用，不仅可以提高检测的特异性和灵敏度，而且还能实现单一样品的多重检测，大大提升了检测的效率和便利性。

2）与纳米材料结合。纳米材料具有较大的比表面积，可充当固定化载体、信号放大器、磁性分离器等，与仿生受体结合使用，可开发出更具选择性和敏感性的生物传感器[48-49]。

3）实际样品适用性。一般情况下，仿生识别受体的选择性受实际样品条件的影响，包括：干扰组分（例如：脂质、蛋白质、维生素和碳水化合物）、离子强度、pH 值和黏度等。而且，受体与样品组分之间的非特异性相互作用还可能导致结果的假阳性。因此，在大多数生物传感器中，都需要对样品进行预处理。通过尽可能简化样品预处理过程，可以更好地满足实际和复杂样品中特定目标物的检测。

4）商业应用。仿生识别元件（比如：MIPs 和aptamers）的主要局限在于它们的商业开发仍处于起步阶段。近年来，研究者们开发了一些可商购生物传感器用于抗生素检测。但是还存在稳定性不足、不够廉价以及无法实现多重检测等问题。因此，用于抗生素检测的生物传感器仍是亟待建立的潜在市场，并且与其他生物传感领域相比，该领域的研究还很不够。