甜菜连作土壤对甜菜幼苗生长影响及其化感物质成分分析

耿 贵，刘 钰，李任任，杨瑞瑞，路正禹，於丽华，王宇光

（1黑龙江大学生命科学学院，哈尔滨 150080；2黑龙江大学现代农业与生态环境，哈尔滨 150080）

0 引言

连作障碍(continuous cropping obstacles)是指正常管理条件下，同一土地上栽培同种或同科作物持续2年或2年以上，引起作物产质量降低、病虫害发生加剧等不良反应的现象[1-2]。连作障碍是化感自毒物质的积累、土壤微生物区系的改变等诸多因素综合作用的结果，在粮食作物（玉米[3]、高粱[4]、马铃薯[5]）、经济作物（棉花[6]、花生[7]、烤烟[8]）、药用植物（当归[9]、人参[10]、三七[11]）、果蔬类（黄瓜[12]、番茄[13]）等中均有不同程度的体现，造成了巨大的经济损失，严重制约了农业的可持续发展[14-15]。

研究表明，连作种植同样也会影响糖料作物甜菜的产质量。甜菜(Beta vulgaris)是中国重要的糖料作物[16]，作为制糖的原材料，具有很高的经济价值。研究发现，甜菜连作4年之后糖度下降可达6.5℃，根产量下降甚至可达50%，品质严重下降，且连作时间越长，其下降幅度越大，个体长势越差，根产量也越低[17]。甜菜属于忌连作的直根系深根作物，连作种植不仅会导致立枯病、根腐病等土传病害发生率增加，还会严重影响甜菜产质量。大量研究表明，甜菜连作后产生的连作障碍已严重制约了国内甜菜产业的可持续发展，因多年连作而产生的糖度下降、产量降低、病虫害加剧等一系列问题已不容忽视[18-20]。田间条件下，化感物质的释放及作用等往往受到很多自然因素和非自然因素的综合制约[21-23]，因此本研究采用室内土培的方法对比休闲土和重茬土，采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用(SPME-GC/MS)的方式对土壤中的化感物质进行了鉴定分析，避免了在田间条件下各种因素的干扰，同时避免使用有机化学溶剂萃取分离等前处理方式对土壤中原有化感成分造成的干扰。笔者研究休闲土和重茬土对甜菜幼苗生长的差异性，并筛选甜菜疑似化感物质，以期为进一步研究甜菜化感效应、减轻甜菜连作障碍提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用甜菜种子为‘H004’品系，供试土壤材料取自黑龙江大学呼兰校区。取样深度为10～30 cm，采用多点随机取样的方式，除去石子、植物残体等杂物后混合均匀，取一小部分置于-80℃超低温冰箱保存（用于SPME-GC/MS分析），剩下的土壤置于4℃低温条件保存（用于盆栽试验）。不同土壤的基本理化性状见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 本试验采用盆栽方式，在黑龙江大学农学楼光照培养室内进行，培养室条件为每日光照14 h，温度为(25±1)℃，夜间10 h，温度为(20±1)℃，相对湿度为60%～70%。试验共设置休闲土（甜菜地附近的休闲土壤）、重茬土（种植过一茬甜菜的土壤）2个处理组，每个处理设置8个重复。每盆先放1200 g土壤，均匀放入15粒甜菜种子后，再用300 g土覆盖。定期补充水分，更换处理位置，保证所有处理的常规管理一致。种子发芽期间每天统计各试验组的发芽数和病株数，定期定量补充改良Hoagland营养液，发芽结束后定期进行间苗，每盆保留5株幼苗，生长至28天时进行基本形态指标的测定。对土壤进行取样，采用SPME-GC/MS联用技术对2种土壤进行比较分析，筛选导致甜菜连作障碍的疑似化感物质。

1.2.2 发芽率和病株率统计 发芽率是指发芽终期（前12天内）正常发芽粒数占全部种子数的百分比；病株率为该处理所有重复处理中甜菜病株数占已发芽幼苗总株数的比值。

1.2.3 生长指标测定 游标卡尺测量甜菜幼苗根茎粗；直尺测定甜菜幼苗株高，以植株心叶到叶片尖端的距离为准；使用WinRHIZO扫描软件分析幼苗叶面积；从根茎部将幼苗剪下，电子天平获取幼苗地上部质量。

1.2.4 土壤样品GC-MS分析 检测仪器包括气相色谱(Agilent 7890B)、质谱仪(Agilent 5977B)，色谱柱为Agilent DB-Wax。试验试剂为2-辛醇（纯度≥99.5%）。

（1）代谢物提取。称取5 g土壤于20 mL顶空瓶中，再加入10 μL 2-辛醇为内标。以随机顺序进行GC-MS检测。（2）上机检测。Agilent 7890气相色谱-质谱联用仪配有Agilent DB-Wax毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm，J&WScientific，Folsom，CA，USA)。（3）GC-MS具体分析条件：萃取温度80℃；预热时间15 min；萃取时间30 min；解析时间4 min；分流模式为Splitless Mode；隔垫吹扫流速3 mL/min。（4）数据处理：使用ChromaTOF软件和NIST库对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐、质谱匹配等分析。人工分析后使用NIST05谱库进行质谱匹配等分析，以确定样品中所检测出的各组分的化合物结构及名称。以P值小于0.05为标准进行2组土壤中差异有机物的筛选。

表1 供试土壤的基本理化性状

1.2.5 数据统计与分析 采用Excel对试验数据进行整理，采用SPSS软件进行单因素方差分析结果，均用“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同土壤种植条件下甜菜种子发芽率和病株率的比较

各处理中，甜菜播种后第5天开始发芽，第10天发芽基本完成。由表2可知，休闲种植中甜菜种子的平均发芽数均13粒，发芽率为86.67%，连作种植中甜菜种子发芽总粒数为12粒，发芽率为85.83%。不同土壤处理组对甜菜种子的平均发芽数和发芽率影响不大。

由表3可以看出，连作种植的幼株发病率较高，达到8.74%，而休闲种植的幼株病株率仅为1.92%，连作土壤种植组甜菜种子的病株率明显高于休闲土壤种植组。

2.2 不同土壤种植条件下甜菜生长指标的比较

从图1可以看出，与休闲种植相比，连作种植会导致甜菜幼苗的株高、叶面积和地上部鲜重显著降低（P＜0.05，下同），其中株高降低了6.06%，叶面积减少了5.71%，地上部鲜重显著降低了16.93%。但对茎粗的影响不大，未达到显著水平(P＞0.05)。

2.3 不同处理土壤的SPME-GC/MS分析结果

为探究休闲土和重茬土根系分泌物的差异，筛选鉴别出导致甜菜连作障碍的疑似化感物质，采用气相色谱法-质谱法联用(GC-MS)方法对2种土壤中的化学成分进行检测。得到2种土壤SPME-GC/MS分析的离子流图（图2）。

根据SPME-GC/MS的化学成分分析结果，比较分析2种土壤中的差异代谢物。经归一化处理后进行分析，在本试验所设置的土壤处理中，共得到约765种化学成分，以P值小于0.05为标准进行筛选，获得共15种疑似化感物质的化合物（表4），可分为酯类、醛类、酮类、醇类、酸类、胺类等类别。

3 结论

本试验发现连作种植对甜菜种子的发芽率无影响，但会极大提高甜菜幼苗立枯病发病率，并且影响甜菜幼苗生长，以休闲土和重茬土为试验材料，经过比较筛选共获得15种差异显著的化学物质，有待于进一步深入研究。目前关于化感作用的研究多集中于实验室控制试验，虽然在最大程度上避免了多种外界因素的干扰，但还是具有一定的局限性，如只能观察一个或几个关键时期、研究一种或几种关键化感物质，如何进行综合性、全方位、长周期、多尺度的对化感物质进行研究，仍是未来需要解决的问题。

表2 不同处理条件下甜菜种子发芽数及发芽率的比较

表3 不同处理条件下甜菜种子发芽过程中病株数及病株率的比较

图1 不同土壤处理对甜菜各项生长指标的影响

图2 不同土壤的SPME-GC/MS分析总离子流图

4 讨论

连作障碍是作物、土壤、微生物等多种因素综合作用的结果[20]。在本研究中，各处理组甜菜种子发芽率在85.00%～88.33%之间，连作处理并未对甜菜种子的发芽产生明显影响，而甜菜连作后，幼株立枯病的发病率明显升高，这与魏良民等[17]对甜菜连作的田间试验研究结果一致。同时，甜菜幼苗株高、叶面积以及地上部鲜重显著降低，李艳红等[24]推测是由于前茬作物根系分泌、植株残茬腐解等作用积累了大量化感物质，作用于幼株根部后，影响了幼株地上部的正常生长，同时使得土壤微生物群落结构失调、酶活性降低，不仅导致土壤质量降低，还造成甜菜幼株生长不良、生物量降低。

本研究将休闲土和重茬土经过GC-MS分析，以P＜0.05为条件进行差异代谢物的筛选，共获得15种疑似化感物质的化合物，其中邻苯二甲酸丁-3-己酯与标准谱库匹配程度最高，达到958，其保留时间也较长，可能是与邻苯二甲酸功能相关的一种新的化感物质。研究发现，邻苯二甲酸能够抑制植物根系吸收水分和养分的能力，还能破坏植株生物膜结构、减弱植株抗逆能力[25]。另外发现其衍生物如邻苯二甲酸二丁酯(DBP)[26]、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)等[27]，能够作为植物根系分泌物中重要的化感物质，影响种子发芽、幼苗生长或根系生理代谢等活动，且对不同植物表现出不同的化感促进或化感抑制作用，推测邻苯二甲酸丁-3-己酯可能也是邻苯二甲酸的一种衍生物，具有以上类似的生理功能。苯甲醛作为酚酸类化感物质，研究发现一定浓度的酚酸类化感物质能够影响植物光合作用和酶活性、抑制种子萌发和植物吸收养分等活动[28-30]。本试验鉴定所得结果中还有几种无法确定化学结构的成分，尚需进一步研究，这些可能被归为化感自毒物质范畴的化学成分是否在甜菜及其他生物生长过程中起作用，具体是如何作用的，作用阈值浓度，作用效果，还需进行进一步的研究。此外，本研究仅对种植过一茬甜菜的土壤进行了相关初步研究，而导致作物连作障碍的因素众多，甜菜连作障碍也可能会受到包括环境条件等在内的其他因素影响，针对这些可能的影响因素，今后应进行进一步的深入分析，同时对甜菜连作多年的土壤进行相关研究，并从多个角度出发去探求克服甜菜连作障碍的措施，以实现甜菜产业的可持续发展。

表4 P值小于0.05的15种疑似化感物质