孕前保健男性年龄与精子DNA碎片、精液常规参数的相关性分析*

庾伟坚，路瑞静，江 凡，陈 献，梁淑馨，胡 蝶，周喜友

广东省深圳市宝安区妇幼保健院检验科，广东深圳 518102

研究显示，生殖健康已成为世界性问题，约影响20%的育龄期家庭[1-2]，其中男性因素单独占1/3[3]。众所周知，男性年龄>35岁或是>40岁被认为是高龄，并可直接影响妊娠结局。随着年龄的增加，男性在性激素水平、氧压力、体细胞突变、感染等方面面临更大的选择性压力进而延长备孕时间，严重的可导致体外胚胎植入失败，甚至影响新生命的健康[4-6]。目前临床评估男性生殖能力主要依赖传统的描述性的精液常规检查参数，包括精液体积，精子数量、形态、活力、存活率等，但因无法准确衡量男性生育能力的高低而制约其临床应用。

精子DNA碎片指数(DFI)可衡量精子核DNA结构完整性，是影响胚胎完整发育的关键因素。当精子DNA结构受损时，可影响妊娠结局，例如复发性流产[7]；因此，DFI可成为新的评估精子质量和预测生育结局的临床指标。本研究旨在探讨年龄与精子DNA结构完整性以及传统精液常规各项参数之间的临床关联性，为临床全面客观评估男性生育力提供相关依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年5月至2019年6月在深圳市宝安区妇幼保健院生殖健康科进行孕前保健检查的男性1 237例，年龄21～58岁。排除患有肿瘤、无精子症、精索静脉曲张、配偶不良孕产史、隐睾症等男性患者。依据年龄截点分为3组，分别为20～29岁、30～39岁和≥40岁。

1.2方法

1.2.1精液标本获取 就诊男性禁欲2～7 d，采用手淫法获取精液标本置于无菌取精杯中迅速运送至精液分析实验室。

1.2.2精液常规参数分析 将精液标本置于37 ℃恒温水浴箱中振荡液化30 min，液化完全后进行精液常规检验。采用计算机辅助精子分析系统(CASA)分析获取精液常规各项参数。

1.2.3精子形态参数分析 吸取20 μL混匀的精液标本制作2张精子涂片，采用Diff-Quik (BioMart,深圳,中国)快速染液进行染色。200倍镜下观察精子形态，并连续计数200个精子，计算精子正常形态百分率、精子头部畸形数。

1.2.4精子DFI分析 利用SCSA方法结合流式细胞术检测精子DFI和精子成熟度。检测试剂盒为精子核完整性染色试剂盒(珠海安达圣物科技有限公司，珠海，中国)。流式细胞术至少计数5 000条精子为有效数据。

1.3统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行整理分析，呈偏态分布的计量资料以中位数(M)和四分位数(P25～P75)表示，3组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验，并同时进行组间两两分析；相关分析采用Spearman分析，采用多因素Logistic回归分析各精液参数间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1精液常规参数一般情况 如表1所示，≥40岁男性的前向运动精子百分率、精子存活率与20～29岁男性相比，差异均有统计学意义(P<0.05);≥40岁男性的前向运动精子百分率、精子存活率、精液体积、不动精子百分率与30～39岁男性相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。其中随着孕前保健男性年龄的增加，前向运动精子百分率、精子存活率显著降低(P<0.05)。正常形态精子百分率、精子浓度、精子总数、精子成熟度、禁欲天数、精液pH、非前向运动精子百分率及头部畸形精子百分率等精液临床参数在3组年龄男性中差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2年龄与精子DFI的相关关系 如图1所示，相比20～29岁、30～39岁孕前保健男性群体，≥40岁男性精子DFI显著增加(P<0.001，图1A)；而20～29岁与30～39岁男性群体精子DFI差异无统计学意义(P>0.05；图1A)。年龄与精子DFI存在正相关关系(r=0.11，P<0.000 1，图1B)，表现在≥40岁男性相关关系更显著(r=0.18,P<0.000 1，图1E)，20～29岁和30～39岁男性群体年龄与精子DFI无相关关系(P>0.05，图1C、1D)。

表1 基于年龄分组的精液临床参数一般信息[M(P25～P75)]

注：A为精子DFI在20～29岁、30～39岁、≥40岁孕前保健男性群体之间的分布，两组间比较，*P<0.001，**P<0.000 1；B为孕前保健男性群体精子DFI与其对应孕前保健男性年龄之间的关联性；C为20～29岁孕前保健男性群体中年龄与其对应精子DFI的关联性；D为30～39岁孕前保健男性群体精子DFI与其年龄的关联性；E为≥40岁孕前保健男性群体精子DFI与其年龄的关联性。

2.3精子DFI与其他精液临床参数之间的相关性分析 精子DFI与正常精子形态百分率、精子浓度、前向运动精子百分率、精子存活率、非前向运动精子百分率呈负相关关系(r=-0.21、-0.11、-0.45、-0.45、-0.21，均P<0.05)；而与禁欲天数、精液体积、不动精子百分率、头部畸形精子百分率呈显著的正相关关系(r=0.14、0.13、0.46、0.21，均P<0.05)。与20～29岁男性群体相比，30～39岁及≥40岁男性在前向运动精子百分率、精子存活率、非前向运动精子百分率、不动精子百分率和头部畸形精子百分率这5个精液参数中呈更强的相关关系。见表2。

表2 DFI与精液常规基于年龄分组相关性分析

续表2 DFI与精液常规基于年龄分组相关性分析

2.4多因素Logistic回归分析精子DNA碎片的风险因素 如表3所示，应用多变量Logistic回归分析显示, 年龄、精液体积和不动精子百分率是精子DNA碎片的风险因素(OR=1.031、1.215、1.038)。正常形态精子百分率、前向运动精子百分率、精子成熟度和非前向运动精子百分率是精子DNA碎片的保护性因素(OR=0.912、0.011、0.966、0.968)。

表3 精子DNA碎片与年龄及精液临床参数的多变量Logistics回归分析

3 讨 论

研究证实，年龄增加与精液质量呈负相关关系；年龄可影响性激素水平，增大机体氧化应激压力，增加体细胞突变率，从而进一步影响男性生殖能力[8]。然而，有研究发现男方高龄对处于分裂期的受精卵和胚胎质量并无显著影响[9]。另一项在415对夫妻试管婴儿的研究中发现妊娠结局与男方高龄没有显著关联[10]。因而，目前有关年龄影响男性生育能力的具体的细节性研究仍存在较大争议，亟待更准确地研究评估年龄和男性生育能力之间的关系。

本研究主要阐述年龄对精液常规参数以及精子DNA结构完整性的影响。研究结果显示，年龄的增加可显著影响精子正常形态、前向运动精子百分率、精子存活率、精液体积、不动精子百分率以及头部畸形精子百分率等传统的描述性的精液常规参数。另外，随着年龄的增加，精子DFI也呈显著增加的态势，且年龄与精子DFI呈正相关关系。这种正相关关系更加明显地表现在≥40岁男性群体；年龄在40岁以下的男性群体，精子DFI变化与年龄并无显著相关性。类似的研究结果在一项1 124例≥40岁的男性群体研究中也得到证实[8]。精子DFI是评估胚胎质量的一项关键指标，被广泛应用于生殖实验室，可直接反映精子DNA结构完整性程度，并与男性生殖能力紧密相关。研究表明不育男性的DFI显著高于正常男性[11-12]，因此，本研究进一步分析了精子DFI与传统精液常规参数的关联性，结果发现精子DFI与部分描述性精液常规参数存在正相关或者负相关关系。更重要的是，本研究发现与20～29岁男性群体相比，30～39岁及≥40岁男性在前向运动精子百分率、精子存活率、非前向运动精子百分率、不动精子百分率和头部畸形精子百分率这5个精液参数中呈更强的相关关系。为了消除一些混杂因素的影响，利用Logistic回归分析精子DNA碎片的风险因素，结果证实年龄是精子DNA碎片的独立危险因素。这些结果更进一步证实了年龄可一定程度上影响传统的精液常规参数和精子DNA结构完整性，可为临床生殖实验室评估男性精液质量，特别是高龄男性生育能力提供可靠的证据。

迄今为止，有关年龄如何影响精液参数质与量的研究结论尚未完全明朗，存在多方面影响因素。一些研究显示，由于年龄增加而致使体内活性氧(ROS)的增加、降低精子抗氧化保护屏障以及机体氧化应激反应引发的精子损伤等原因可降低精液质量合格程度[13-14]；类似的研究发现体内过量的ROS水平与精子DNA结构损害程度呈正相关关系。另外，有研究证实男性高龄可能会影响精子DNA结构受损时的结构重塑过程，从而致使精子染色质结构域组装失败并且严重降低其DNA片段修复能力[15-16]。这些研究可在一定程度上解释了高龄男性对氧化应激攻击的脆弱性，从而导致其生育能力低下。因此，后续需要更多的研究聚焦探索年龄影响精子DNA结构改变的其他机制，如生殖细胞突变等方面机制。由于回顾性分析的限制，本研究未能收集到其他地区以及不同生活环境的受试者信息以减少偏倚性，因而后续也需要不同地域的多中心的临床和实验室研究印证结果的准确性。