灌木型柳树杂种无性系铅的积累特性及其遗传变异

黄瑞芳，王红慧，王红玲，施士争*

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153； 2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014； 3.江苏省农产品质量检验测试中心，江苏 南京 210036)

铅不能被生物代谢所分解，且能通过食物链在动物和人体内富集，对肾脏、血液、神经系统等危害极大[1-2]。柳树积累性高，植物修复能力强，适合用于修复重金属污染[3-5]。灌木类柳树适应性强,速生,生物量大,扦插造林成本极低。根系发达，比表面积大，且主要分布在深0—40 cm的土层，位于重金属主要分布层[6-8]。灌木柳条还可用作工业原料、编织工艺、生物能源和园林观赏等，具有较高的经济价值，又不直接与食物链相联系，与草本相比，优势明显[9-10]。

植物对重金属积累特性的遗传变异规律是研究植物修复的基础和关键，目前在重金属对植物的毒性效应上研究较集中，对植物的重金属积累特性遗传变异研究较少。本文以作者前期筛选的铅耐受性强的无性系作为父母本[11]，共8个杂交组合的51个灌木柳树无性系为试验材料，以前期确定的适宜铅污染浓度[12]，通过水培方法测定了其在铅污染状况下(300 μM)的成活率、受害指数，分根、茎、叶测定了铅含量和铅总量，旨在分析灌木柳树杂交组合间的铅积累特性及其遗传变异差异，掌握灌木柳树重金属积累特性的遗传变异特征，以便为柳树的重金属耐性遗传改良提供理论依据，筛选具有更高重金属富集能力的无性系或基因型，提高修复效率，加快修复进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为笔者于2013年根据重金属耐受性进行定向杂交所获得的子代，包括杞柳×簸箕柳的杂交组合，簸箕柳×簸箕柳的2个杂交组合，以及毛枝柳×簸箕柳、毛枝柳×黄花柳和二色柳×簸箕柳的各1个杂交组合。经过苗期初筛，选取的8个杂交组合共51个灌木柳树无性系(见表1)。所有的灌木柳树均来自于江苏省林业科学研究院国家柳树良种基地柳树种质资源圃。

表1 供试无性系

1.2 试验方法

试验采取水培法。所有灌木柳树于2020年3月从江苏省林业科学研究院柳树种质资源圃采穗，均选取长15 cm、直径为1 cm的健壮插穗，清水培养14 d后，挑选生长势一致的柳树苗，置于定植篮中，每篮10株。用改良Hoagland′s培养液培养28 d后进行铅处理14 d，之后收获植株。Pb2+以Pb(NO3)2的形式加入，浓度为300 μM。试验设置重复3个，每重复10株。试验过程中每7 d换培养液1次。为避免铅产生沉淀，开始铅胁迫后，培养液中不再加入KH2PO4。

1.3 测定方法

本试验以灌木柳树无性系受铅胁迫后的受害指数[13]、生物量以及体内铅含量为分析指标。胁迫实验结束后分根、茎、叶收获植株，先用自来水冲洗，然后用去离子水反复冲洗干净并用吸水纸擦干，根部用EDTA洗去表面附着的铅，105 ℃杀青30 min后，烘干至恒重，分别称其生物量(即干物质量，dry weight，DW)。按照《食品安全国家标准 食品中铅的测定》(GB5009.12-2017)中的方法进行植物根、茎、叶铅含量的测定。受害指数根据参试无性系的受害等级进行计算，共分为7个受害等级(见表2)，受害指数(P)按照以下公式计算：

表2 柳树受害症状的分级标准

其中，ni为达到第i等级的株数；ki为第i等级的分值，i=0，1，…6。

得到的数据利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19分析。

2 结果与分析

2.1 铅胁迫下不同杂交组合的成活率比较

成活率反映了灌木柳树在受到铅胁迫时的生长状况，对铅胁迫下各灌木柳树的成活率进行统计，对不同杂交组合进行差异比较(见表3)，结果显示：不同杂交组合间的成活率存在显著差异，P1025×P63的成活率最低，只有(71.52±36.94)%， 而P646×P63，P1024×P63，P126×P63和P126×P585的成活率均达到100%。变异最大的为P1025×P63杂交组合，变异系数为51.65%。

表3 灌木柳树杂交组合的成活率

2.2 铅胁迫下不同杂交组合的受害指数比较

本文用受害指数反映铅胁迫下灌木柳树的受害等级和灌木柳树对铅的耐性能力。铅胁迫下各无性系的受害指数分布范围为2.08%—97.22%，受害指数在10%以下的有6个无性系，在10%—50%之间的有26个无性系。受害指数较低的10个无性系见表4。

表4 受害指数较低的灌木柳树排名

铅胁迫下各杂交组合的受害指数见表5。由表5可知，P126×P585的受害指数显著低于其他杂交组合，只有(3.70±2.27)%，P294×P63的受害指数最高，为(58.54±25.52)%。杂交组合内变异最大的为P1025×P63(变异系数达到63.11%)，变异最小的为P126×P63(变异系数为31.14%)。

2.3 铅胁迫下不同杂交组合的生物量比较

铅胁迫下各杂交组合的生物量见表5。生物量分布范围为0.28—20.17 g，在铅胁迫下，不同杂交组合间的生物量平均值存在一定差异， P126×P63的子代的生物量平均值显著大于其他杂交组合，为(13.85±4.95) g ，生物量平均值最小的为P294×P63[(6.05±4.84) g]。变异最大的为P294×P63，变异系数达到79.97%，变异最小的为P126×P585，变异系数为8.76%。

表5 铅胁迫下灌木柳树的受害指数和生物量

不同杂交组合的存活率、受害指数和生物量的平均值均存在一定差异，但各杂交组合的子代无性系相应的变异系数也较大，这就说明每个杂交组合内的子代无性系间存在较大的差异。相同杂种组合杞柳×簸箕柳的3个不同的杂交组合的存活率、受害指数和生物量均存在显著差异。

2.4 铅胁迫下不同杂交组合的铅含量比较

为了进行无性系水平上的铅积累能力比较，本文以生物量和受害指数为指标，选择生物量和受害指数都超过平均值的共计20个无性系进行根、茎、叶铅含量测定的分析，这20个无性系隶属的杂交组合见表6，测定结果见图1。

表6 20个无性系隶属的杂交组合

方差分析结果显示各无性系的铅含量存在显著差异。从图1可以看出，参试无性系的不同部位的铅含量相差很大，叶部铅含量在7.8—32.8 mg/kg，茎部铅含量在10.5—42.3 mg/kg，而根部铅含量在792.3—3 498.3 mg/kg，根部的铅含量是茎、叶部铅含量的近百倍。

图1 铅胁迫下灌木柳树不同部位(根、茎、叶)的铅含量

参试无性系的叶部铅含量和茎部铅含量的高低并没有表现出一致性，其中茎部铅含量大于叶部铅含量的无性系有12个，而叶部铅含量大于茎部铅含量的无性系有8个。

2.5 铅胁迫下灌木柳树的铅总量

为评估各无性系生物修复能力，现对各无性系的铅总量进行测定，从而得出各无性系体内固定的铅总量，结果见图2。

方差分析结果显示各无性系的铅总量存在显著差异。从图2可以看出，整株铅总量在776.53(无性系16)—3 549.61 μg(无性系23)。虽然根部的生物量较小，但是铅含量极显著高于茎和叶，根部铅总量占整株铅总量的64.47%(无性系43)—91.28%(无性系28)，茎部铅总量占比为3.70%(无性系17)—16.08%(无性系51)，叶部铅总量占比为4.45%(无性系28)—20.72%(无性系43)。

图2 铅胁迫下灌木柳树不同部位(根、茎、叶)的铅总量

2.6 铅胁迫下不同杂交组合及无性系的铅积累特性的比较

对无性系超过3个的杂交组合进行差异性显著分析及多重比较(见表7)，符合条件的有P336×P63，P61×P63和P126×P63等3个杂交组合，各杂交组合的根铅含量为1 548.75—1 962.95 mg/kg，铅含量无显著差异，变异最大的为P336×P63，变异系数为50.79%，变异最小的为P61×P63，变异系数为36.81%；铅总量在1 644.51—2 431.42 μg，铅总量也无显著差异，变异最大的为P61×P63，变异系数为45.91%，变异最小的为P126×P63，变异系数为39.72%。

表7 杂交组合子代无性系(>3个)的铅含量和铅总量的变异

虽然杂交组合间的铅积累特性无显著差异，但对20个无性系的根、茎和叶的铅含量以及铅总量进行方差分析显示：各无性系间存在较大的差异。

3 结论与讨论

本研究中，铅处理后柳树的存活率、受害指数、生物量在供试8个杂交组合间均存在明显差异，总体而言，P126×P585的存活率达到100%，受害指数低至3.70%，生物量为10.77 g，表现较好；而P1025×P63的存活率低至71.52%，受害指数高达53.47%，生物量也低至6.55 g，表现较差。

魏童等[14]的研究显示，青杨的镉富集能力在种群间和无性系间都存在明显的变异性，表明可以通过开展种源/无性系选择，选育出富集能力更高的基因型，从而提高植物修复的效率。Yang等[15]研究比较了12个柳树无性系在50 μmol/L铜、锌营养液中耐铜、锌能力的变化，结果显示柳树对铜和锌的耐性和积累量因无性系而异。本研究中铅处理后柳树根、茎和叶中的铅含量和铅总量在杂交组合间无显著差异，但在无性系间存在显著差异。由无性系的铅含量变异性和分布可以看出，无性系间的变异很大，其中更能衡量富集能力的根中铅含量最高的无性系为12号，达到3 498.3 mg/kg，根中铅含量最低的无性系为16号，只有792.3 mg/kg。整株体内铅总量较高的有无性系23，35，28，40,12号，较低的有无性系16，22，51，11,4号。由此可见柳树的铅富集能力在无性系间存在明显的变异性，这也显示在良种选择上可以直接在无性系水平上选择。

本研究中的无性系43号，受害指数较低，为5.56%，体内的铅含量也较低，为828.67 mg/kg。这可能是因为该无性系在铅胁迫下拒绝主动吸收对生长有害的铅[16]，通过合成胼胝质或Fe-Mn氧化膜等物质来组织重金属进入根系[17]，这些无性系被认为是较耐铅的品种。而本试验中的无性系12号和40号，其受害指数分别为2.08%和4.63%，但是其铅含量却高达3 498.33，2 943.67 mg/kg。这可能是由于该无性系主动吸收了铅之后通过体内螯合、储存在体内活性较弱的组织等手段使铅对自身生长的危害降到最低[18]。这些无性系应是铅高积累品种，是适合大量提取环境中的铅污染进行生物修复的专用品种，这为进一步研究其耐铅和铅积累机理及进行生物修复提供了材料。

本研究中参试无性系的叶部铅含量和茎部铅含量的高低并没有表现出一致性。这与房娟[19]的研究不同，该研究认为根>茎>叶，可能是因为其参试无性系较少，只有垂柳和苏柳172良种乔木柳，本试验的无性系较多，为20个灌木柳无性系。到底是因为乔木柳和灌木柳的不同，还是无性系个数造成试验结果的差异，还有待进一步试验。

施翔等[20]的研究显示Pb向地上部的转移相对较少，根部是铅在柳树体内存储的主要库。本研究显示，灌木柳树在受到铅胁迫时，根部铅总量占整株铅总量的64.47%—91.28%，这就表明铅主要积累在根部，而茎、叶中含量较少，这可能是由于Pb在根系主要以沉淀形式存在，如Pb3(PO4)2和PbCO3等，且重金属大部分储存在结构栓化和木质化的根表皮部[21]，因此很难向地上部进行长距离运输[22]。在土壤铅污染生物修复中，可以选择铅积累能力强的灌木柳树无性系，通过蘸取生根剂等方法促进根系生长，在每年年底落叶前收割地上部分，从而减少枯枝落叶中的污染物回田，于第3年利用小型农机翻耕土地收获灌木柳树根部，从而修复重金属污染土壤，相应缩短修复年限，这较其他木本植物具有较强的优势。