多源化巨细胞病毒DNA定量检测在异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒肺炎诊断中的应用

程昊钰 杨帆 杨怡欣 张书芹 张永平 张维婕 费新红 殷宇明 顾江英 王静波

巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是造血干细胞移植后常见并发症之一，严重影响受者预后，其中CMV肺炎是造血干细胞移植失败和受者死亡的重要原因[1-2]。CMV肺炎占移植后CMV病的40%～60%，病死率高达30%～50%[3]。CMV肺炎诊断的金标准为肺活组织检查（活检）中检测到典型病毒包涵体，或通过免疫组织化学染色、原位杂交检测到细胞内病毒。然而，肺活检风险较高，目前CMV肺炎的确诊主要依赖于气道分泌物中找到病毒包涵体、特异性抗原或DNA片段，其首选检查方法为纤维支气管镜镜检+肺泡灌洗，由于纤维支气管镜镜检受到受者血象、凝血功能等的限制，CMV肺炎的诊断很大程度上依靠痰液、血浆CMV DNA检测及影像学检查。

本研究回顾性分析接受异基因造血干细胞移植的受者中CMV肺炎的发生情况，分析CMV肺炎受者不同来源标本的CMV DNA载量，总结其对诊断CMV肺炎的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料与分组

回顾性分析2017年1月至2019年10月在航天中心医院接受异基因造血干细胞移植的405例受者的临床资料，移植前所有受者CMV IgM检测结果阴性。所有受者的移植术后随访时间6个月以上。405例受者中，诊断为CMV肺炎的19例受者设为CMV肺炎组，其中男16例，女3例，年龄36（16，52）岁，包括3例非血缘全相合造血干细胞移植和16例单倍体移植。原发病包括急性髓细胞白血病14例，急性淋巴细胞白血病4例，慢性髓系白血病1例。

选取同期仅发生CMV血症（血浆CMV DNA载量>500 copies/mL）的229例受者设为对照A组，接受纤维支气管镜镜检的11例非CMV肺炎受者设为对照B组，根据病原学证据确诊细菌或真菌性肺炎进行痰培养的16例受者设为对照C组。3个对照组的基线资料分别为：对照A组，男148例，女81例，年龄32（20，43）岁，急性髓细胞白血病153例，急性淋巴细胞白血病62例，骨髓增生异常综合征6例，急性混合细胞白血病5例，再生障碍性贫血3例；对照B组，男7例，女4例，年龄32（23，42）岁，急性髓细胞白血病8例，急性淋巴细胞白血病3例；对照C组，男12例，女4例，年龄34（25，49）岁，急性髓细胞白血病11例，急性淋巴细胞白血病4例，再生障碍性贫血1例。CMV肺炎组与3个对照组受者之间的基线资料比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。

1.2 预处理方案

19例CMV肺炎受者中有9例采用白消安（busulfan，Bu）+环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）基础上联合去甲氧柔红霉素（idarubicin，IDA），加或不加FLAG [氟达拉滨（ fludarabin，FLu）+阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）+粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）]或CLAG [克拉屈滨（cladribin，CLA）+Ara-C+G-CSF]的预处理方案，9例采用全身照射（total-body irradiation，TBI）+Ara-C+CTX或TBI+FLAG或TBI+CLAG加或不加IDA的预处理方案，1例采用TBI+塞替派+奈拉滨+巯嘌呤的预处理方案。

1.3 造血干细胞移植及随访情况

19例CMV肺炎受者白细胞均成功植入，植入时间为15（9，28）d；12例CMV肺炎受者血小板成功植入，植入时间为16（9，75）d。白细胞植入标准为外周血中性粒细胞连续3 d超过0.5×109/L；血小板植入标准为血小板脱离输注后连续7 d超过20×109/L。通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测DNA指纹图，供、受者性别不同时可通过荧光原位杂交技术检测性染色体。移植术后根据原发病情况，每3～4周行骨髓穿刺检查，半年后每2～3个月行骨髓穿刺检查。

1.4 移植物抗宿主病的预防

单倍体及非血缘移植受者在-5～-2 d加用抗人T细胞免疫球蛋白（anti-human T lymphocyte immunoglobulin，ALG）（德国萌蒂公司，25 mg/kg）或抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）（法国赛诺菲公司，8 mg/kg）。所有受者给予环孢素（ciclosporin，CsA）+吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）+短程小剂量甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）预防移植物抗宿主疾病（graft-versus-host disease，GVHD）。GVHD按照美国西雅图标准进行诊断和分级[4]。

1.5 CMV感染的预防及监测

所有受者于预处理的-5～-2 d给予更昔洛韦，术后1 d给予阿昔洛韦。移植术中所有血制品未做CMV抗体检测，输注的血制品常规采用2 500 cGy照射。全部患者于白细胞植入开始采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测血浆的CMV DNA，每周2次直至移植术后3～6个月，此后根据受者情况每周或隔周检测1次，直至停用全部免疫抑制剂。出现呼吸道症状的受者，同时检测痰液的CMV DNA。行纤维支气管镜检查的受者检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的CMV DNA。RT-PCR测定血浆、痰液和BALF标本，CMV DNA载量>500 copies/mL即为阳性。

1.6 CMV肺炎的诊断与治疗

移植后CMV肺炎诊断标准：（1）移植后受者出现发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状，伴或不伴有低氧血症；（2）胸部CT检查示肺部弥漫性磨玻璃影或斑片状阴影或间质性改变，伴或不伴有胸腔积液；（3）RT-PCR法检测纤维支气管镜镜检BALF的CMV DNA载量>1 000 copies/mL。（4）血浆CMV DNA阳性，CMV DNA载量>1 000 copies/mL，不能单纯用其他肺部感染或肺部GVHD解释的肺部病灶。（5）抗病毒治疗有效。具备上述标准的第1～2条，同时符合第3～5条中的任意1条即可诊断。

CMV肺炎治疗方案包括：（1）CMV肺炎受者首选给予更昔洛韦治疗，1周后效果不佳、白细胞或血小板较前下降的受者则改用膦甲酸钠。（2）对于单药（更昔洛韦或膦甲酸钠）治疗效果不佳的受者，可给予更昔洛韦联合膦甲酸钠治疗，至CMV DNA连续2次阴性后停药。抗病毒同时可加用人免疫球蛋白辅助治疗。（3）当受者抗病毒治疗后出现白细胞或血小板下降及肾功能不全，且抗病毒治疗无效时，可给予CMV特异性静脉注射用免疫球蛋白（CMV-intravenous immunoglobulin，CMV-IVIG），或给予供者CMV特异性细胞毒T淋巴细胞（CMV-cytotoxic T lymphocyte，CMV-CTL）输注（但其有可能导致GVHD加重的风险），同时仅给予预防量的阿昔洛韦。

1.7 研究内容

总结CMV肺炎的发生情况，包括CMV肺炎的发生率、发生时间、临床症状、影像学表现以及合并感染情况；分析CMV肺炎受者不同来源（血浆、痰液、BALF）标本的CMV DNA载量，分别与对照A、B、C组比较；总结CMV肺炎受者的预后情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。对于非正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CMV肺炎的发生情况

405例异基因造血干细胞移植受者中有19例发生了CMV肺炎，CMV肺炎总体发生率为4.7%（19/405）。19例CMV肺炎受者中，13例发生于移植后3个月内，4例发生于移植后3～6个月，2例发生于移植后6个月后。405例异基因造血干细胞移植受者中，单倍体及非血缘移植受者有308例预处理应用ALG，其中17例发生CMV肺炎，34例预处理应用ATG，其中2例发生CMV肺炎，CMV肺炎发生率均为6%，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。

19例CMV肺炎受者的临床症状包括16例咳嗽、咳痰，15例伴有低氧血症，10例双肺湿啰音（其中5例同时伴有干啰音），9例胸闷、气短，8例出现痰中带血或咯血，6例出现发热。CMV肺炎的影像学表现并不特异，需结合其他临床表现进行诊断。CMV肺炎受者中，16例表现为弥漫性磨玻璃影，8例表现为弥漫性小结节影，6例表现为多发斑片状实变影，3例有树芽征或网格影，6例合并有胸腔积液。

19例CMV肺炎受者中，11例合并肺部GVHD，6例合并肺部真菌感染，3例合并肺部细菌感染（包括铜绿假单胞菌1例、溶血性葡萄球菌1例、鲍曼不动杆菌1例）。

2.2 CMV肺炎受者多源化标本的CMV DNA载量

19例CMV肺炎受者中18例在诊断CMV肺炎时的血浆CMV DNA为阳性，仅1例在诊断后1周血浆CMV DNA才转为阳性。CMV肺炎受者的血浆 CMV DNA载量为 7.41×103（1.20×103，1.25×105）copies/mL，高于对照 A 组的 1.79×103（5.0×102，8.43×104）copies/mL（P<0.05）。

6例CMV肺炎受者进行了纤维支气管镜检查，BALF的 CMV DNA均为阳性，CMV DNA载量为1.42×104（6.48×103，2.18×106）copies/mL，高于对照B组的2.34×102（0，2.28×104）copies/mL（P<0.05）。

15例CMV肺炎受者进行了痰液CMV DNA检测，CMV DNA 载量为 5.61×103（0，1.73×107）copies/mL，高于对照C组的0（0，1.04×104）copies/mL（P<0.05）。

2.3 CMV肺炎受者的预后情况

19例CMV肺炎受者的治疗及预后情况见表1。19例受者中，有12例受者经抗病毒治疗后治愈，7例受者治疗失败死亡（其中3例放弃治疗），病死率为37%（7/19）。

7例死亡受者中，5例受者在一线抗病毒治疗的基础上联合应用CMV-IVIG治疗，其中1例因CMV肺炎合并肺部GVHD出现急性呼吸衰竭，继而多器官衰竭，最终死亡；2例死于CMV及细菌混合性肺炎所致的呼吸循环衰竭；2例放弃治疗。1例受者联合应用CMV-IVIG+供者CMV-CTL输注，后放弃治疗。1例受者联合应用西多福韦+CMV-IVIG治疗，死于肺部细菌、真菌及CMV混合感染所致的呼吸循环衰竭。

表1 CMV肺炎受者的治疗及预后情况Table 1 Treatment and prognosis of recipients with CMV pneumonia

3 讨 论

2014年的“CMV药物开发论坛”对移植后CMV感染的相关名词和定义进行了更新[3]，提出“确诊的CMV肺炎”和“拟诊的CMV肺炎”的诊断标准。后者的诊断标准为具有肺炎相应的临床症状、体征，BALF中CMV分离、培养或CMV DNA定量检测阳性。由于肺活检对于移植后受者存在较高风险，受者配合度较低，所以在临床上移植后确诊的CMV肺炎很少，大多为拟诊的CMV肺炎。本研究中CMV肺炎的临床诊断标准即以此标准作为参考。

目前CMV肺炎的实验室检测包括CMV DNA检测、CMV抗原检测、CMV血清抗体检测、CMV培养以及组织病理学检查[5-6]。临床上应用最广泛的是CMV DNA检测，其灵敏度高且检测较快，是临床诊断CMV感染的重要手段。本研究采用RT-PCR检测CMV DNA，标本来源包括血浆、痰液和BALF。结果显示19例CMV肺炎受者的血浆CMV DNA载量高于CMV血症受者，15例CMV肺炎受者痰液CMV DNA载量高于非CMV肺炎受者，而6例接受纤维支气管镜镜检的CMV肺炎受者，其BALF的CMV DNA载量亦高于非CMV肺炎受者。上述结果均提示，虽然不能仅依靠CMV DNA载量作为CMV肺炎的诊断依据，但其对诊断具有一定的支持作用，特别是当CMV DNA载量较高时，可结合受者的临床表现、影像学改变作出CMV肺炎的临床诊断。有类似研究报道，CMV DNA载量>10 000 copies/mL时，CMV肺炎发生率明显增加，以此作为抗病毒抢先治疗标准[7]。

BALF的CMV DNA检测是目前诊断CMV肺炎最有价值的手段[8-9]，但其阳性预测价值较差，正常人群中也可检出。CMV DNA定量检测的灵敏度更高，但目前尚未能标准化，缺乏统一的诊断界值。研究表明，CMV肺炎患者BALF的CMV DNA载量明显高于非CMV肺炎患者[10]。有类似研究显示BALF的CMV DNA载量5 500 copies/mL对于诊断CMV肺炎的灵敏度为0.91，特异度为0.75[3]。另一方面，BALF的CMV DNA阴性预测值接近100%，可以排除CMV肺炎的可能性。

19例CMV肺炎受者中，13例发生于移植后3个月内，4例发生于移植后3～6个月，2例发生于移植后6个月后。类似研究显示CMV感染主要发生在移植后30～90 d[11]，其原因可能与患者的免疫功能缺陷和恢复时限有关。本研究中19例CMV肺炎受者中最常出现的症状包括咳嗽、咳痰、低氧血症、胸闷、气短、痰中带血，仅6例受者出现发热。CT在检测肺部病灶方面更为敏感，CMV肺炎可表现为斑片状或弥漫性磨砂玻璃影，网状混浊，小叶间隔增厚，也可见树芽征[12]。本研究中16例受者CT表现为磨玻璃影，其病理改变主要为间质改变和肺泡损伤。CMV肺炎的影像学特点可以作为临床诊断的依据之一。

近年来由于抢先抗病毒治疗以及新型抗病毒药物的应用，CMV肺炎的病死率明显降低[13-24]。本研究中的19例CMV肺炎受者病死率为37%（7/19），治愈的12例受者中仅2例在给予更昔洛韦或膦甲酸钠后治愈，其余10例均联合了CMV-IVIG和（或）供者CMV-CTL治疗。7例受者接受了CMV-IVIG联合供者CMV-CTL治疗，除1例放弃治疗外，其余6例均治愈且未出现不良反应，安全性及有效性较高。

造血干细胞移植后CMV肺炎的易感因素包括：供者血清CMV抗体阴性而受者血清抗体阳性、无关供者或单倍体亲缘供者、预处理强度大、脐血移植、使用大量免疫抑制剂、移植后未给予预防CMV治疗、中重度GVHD及移植后半年内受者免疫功能尚未恢复者[25-27]。多个指南建议移植后100 d内应至少每周进行外周血血浆CMV DNA检测。对于上述高危患者，时间应延长至移植后6～12个月[28]。

综上所述，CMV肺炎是造血干细胞移植失败和受者死亡的重要原因，其临床诊断需要结合临床表现、影像学特点和CMV DNA检测。血浆、痰液、BALF的CMV DNA检测可在一定程度上提高CMV肺炎的诊断率，从而改善异基因造血干细胞移植受者的预后。