YAP和β-catenin在卵巢癌中的表达及临床意义

李琳，叶丽平

(1.锦州医科大学病理生理学教研室，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属盘锦辽油宝石花医院检验科，辽宁 盘锦 124010)

卵巢恶性肿瘤是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌而居第三位，但却是导致女性癌症死亡的首要原因。卵巢癌发病隐匿，具有异质性，目前仍缺乏有效的早期诊断和治疗手段。研究表明，肿瘤的发生发展与细胞信号通路活性异常密切相关[1-2]。YAP(yes-associated protein，Yes相关蛋白)，是Hippo信号通路的关键分子，参与调节细胞增殖、存活和分化，器官的发育、再生和干细胞等生物学功能，并与肿瘤的发生发展相关[3-4]。β-连环蛋白(β-catenin)是Wnt 信号通路的重要效应蛋白分子，在肿瘤中高表达并调节细胞的增殖、侵袭和凋亡等生命活动[5-6]。近年来越来越多的研究证实，Hippo/YAP通路与Wnt/β-catenin通路存在相互交叉作用，协同促进肿瘤的发生发展[7]。本研究应用免疫组化方法检测了YAP和 β-catenin在卵巢癌中的表达情况，并分析了二者之间表达相关性及其各自与临床病理因素的关系，旨在探讨卵巢癌的发病机制，寻找有效的早诊手段和分子靶向治疗药物。

1 材料和方法

1.1 组织来源

基于知情同意原则，收集盘锦辽油宝石花医院住院卵巢癌手术切除的标本66例，所有病例在肿瘤切除前均未进行放、化疗。根据年龄、病理类型、FIGO分期、分化程度、有无淋巴结转移、远处转移进行分组。良性肿瘤组织标本30例，对照组30例取自同时期住院的卵巢切除患者。新鲜组织标本一部分冻存于-80 ℃冰箱备用，用于western blot，一部分经甲醛固定石蜡包埋，用于免疫组化染色。

1.2 免疫组织化学

30例正常卵巢组织、30例卵巢良性肿瘤、66例卵巢恶性组标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规脱蜡至水，3% H2O2室温孵育5～10 min以灭活内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 min×2次，抗原高压热修复，自然冷却至室温。 5%～10% 正常山羊血清封闭，室温孵育 10 min，倾去血清，滴加一抗工作液，4 ℃孵育过夜。PBS 冲洗，5 min×3 次，滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37 ℃ 孵育 10～30 min。PBS 冲洗，5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，中性 树胶封片，光镜观察。采用 0.01 M PBS液代替一抗作阴性对照。用已知YAP，β-catenin阳性的卵巢癌组织切片作为阳性对照。

请两位病理科医师双盲阅片。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，共计500个细胞。按阳性细胞数所占百分比评分：阴性为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。再按染色强度评分：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。按两者乘积分数评分，0～2分为(-)；3～4分为(+)；5～8分为(++)；9～12分为(+++)。

1.3 Western blotting 检测YAP和β-catenin的蛋白表达

将盘锦辽油宝石花医院妇科于2016年5月至2019年5月期间行卵巢手术切除的标本快速冻存，其中卵巢正常组织、良性肿瘤组织、卵巢癌组织各10例。加蛋白裂解液于放有剪碎组织试管内，超声至匀浆状态，在细胞蛋白提取完成后采用Bradford法进行测定。

采用10.0%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳以分离蛋白样品，电转移至PVDF膜，封闭后分别按1∶400和1∶1000的浓度加入YAP、β-catenin一抗和二抗，然后孵育2 h，杂交信号用ECL化学发光试剂盒进行检测。X线曝光，显影定影后扫描。各电泳带的光密度值用Image Pro-plus图像处理软件分析，目的蛋白的相对表达水平通过计算目的片段与β-actin电泳带密度的相对值来表示。

1.4 统计学分析

病理形态学资料采用SPSS 16.0统计软件分析。χ2检验分析YAP，β-catenin表达的差异及其与病理临床参数的关系。Pearson列联系数分析YAP和β-catenin表达的相关性。P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 YAP和β-catenin在正常卵巢组织，良性卵巢肿瘤和卵巢癌中的表达情况

我们应用免疫组化的方法分别检测了YAP和β-catenin在30例正常卵巢组织、30例良性卵巢组织和66例卵巢癌中的表达情况。我们发现YAP阳性表达主要定位细胞核，而β-catenin则主要定位于细胞膜。二者在恶性卵巢组织中的表达均明显高于正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤。YAP和β-catenin分别在30例正常卵巢组织中阳性表达率为10.0%(3/30)和16.7%(5/30)，在30例良性卵巢组织中阳性表达率为33.3%(10/30)和40%(12/30)，在66例卵巢癌中的阳性表达率为57.6%(38/66)和65.2%(43/66)。证明YAP和β-catenin均在卵巢癌中存在过表达，提示与卵巢的恶变有关，见图1。

2.2 YAP、β-catenin的表达与卵巢癌患者临床病理因素的关系

为了进一步明确YAP和β-catenin的临床特点，我们分别统计分析了其表达与年龄，组织类型，FIGO分期，分化程度和淋巴结转移等临床病理因素的关系。结果发现 YAP和β-catenin均与FIGO分期有关，YAP在FIGOⅠ+Ⅱ期中阳性表达率为43.3%(13/30) 明显低于Ⅲ+Ⅳ期中的阳性率69.4%(25/36)，且有统计学差异(P<0.05)。同样，β-catenin在FIGO Ⅲ+Ⅳ期中阳性表达率高于Ⅰ+Ⅱ期(86.1%(31/36)vs 40.0%(12/30)，P<0.05)。此外，YAP在卵巢癌中过表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，β-catenin在卵巢癌中过表达与分化程度有关(P<0.05)。二者的高表达均与年龄，组织类型无统计学差异，见表1、表2。

A：YAP在正常卵巢组织中的表达；B：YAP在良性卵巢肿瘤中的表达；C：YAP在卵巢癌中的表达；D：β-catenin在正常卵巢组织中的表达；E：β-catenin在良性卵巢肿瘤中的表达；F：β-catenin在卵巢癌中的表达

表1 YAP蛋白表达与卵巢癌临床病理学参数关系(%)

表2 β-catenin蛋白表达与卵巢癌临床病理学参数关系(%)

2.3 卵巢癌中YAP和β-catenin的表达相关性

统计分析结果显示66例卵巢癌患者中YAP 和β-catenin 表达均阳性者33 例，均阴性者18 例；YAP 表达阳性、β-catenin表达阴性者5例；YAP 表达阴性、β-catenin 表达阳性者10例，经过Pearson列联系数分析：在66卵巢癌组织中，YAP 和β-catenin 的高表达呈显著正相关(r=0.51，P<0.05)，见表3。

表3 YAP、β-catenin二者表达的相关分析

2.4 Western blotting 检测YAP、β-catenin的蛋白表达

YAP蛋白的分子质量为65 kDa，β-catenin的分子质量为92～95 kD，在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织和卵巢癌组织中均可见YAP、β-catenin的特异性条带出现。

同正常卵巢组织组和卵巢良性肿瘤组相比，卵巢癌组织中的YAP和β-catenin的蛋白表达水平明显更高，且差异有统计学意义(P<0.01)，见表4、图2。

表4 YAP、β-catenin在不同卵巢组织中的蛋白表达

图2 YAP、β-catenin在不同卵巢组织中的蛋白表达

3 讨 论

近年来，卵巢癌发病率呈逐年上升趋势，手术切除仍是治疗的首选方式。然而，卵巢癌发病隐匿，患者就诊时往往失去手术时机，目前仍未有有效的早诊手段，导致卵巢癌仍是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。伴随基因组学的发展，从分子学探讨肿瘤发病机制，为寻找有效的肿瘤诊治靶点提供可能性。

肿瘤的发病机制是多因素，多阶段，多基因之间的共同作用。研究证实在恶性肿瘤中存在多条信号通路的异常激活或失活。YAP定位于染色体11q22，该区域在人类多种肿瘤中被证实存在扩增或杂合型突变。Hippo信号通路的失活可使YAP在细胞浆积累，进入细胞核后与TEAD结合，从而调节目标基因的表达。研究表明，YAP在多种恶性肿瘤中表达异常，如结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞癌、成神经管细胞瘤、食管鳞癌等，并调节细胞的恶性生物学行为[8]。β-catenin是Wnt信号传导过程中的枢纽，当Wnt-1 信号与细胞膜上的受体蛋白Frizled(Ez)蛋白结合后，信号传给dishevelled(DSH/Dvl)，使其过磷酸化，DSH 的过磷酸化抑制了GSK-3β功能，使其不能磷酸化β-catenin 蛋白，导致胞浆内游离的β-catenin 增加，β-catenin进入胞核与转录因子LEF 和TCF形成复合物，促进如：c-myct 和cyclinD1 等下游靶基因的表达，从而影响细胞的增殖、分化、凋亡等行为[9]。已有研究证实Hippo/YAP通路与Wnt/β-catenin通路在肝癌、大肠癌、乳腺癌和胶质瘤中存在协同促进肿瘤的恶性进展的作用[7，10-11]71-79。但在卵巢癌中的作用研究尚未明确。

本研究证实YAP和β-catenin在卵巢癌中均存在过表达，提示与卵巢癌的发生和恶性进展有关。YAP在Hippo通路失活条件下，在细胞浆中聚集入核后发挥转录活化因子的作用。β-catenin在Wnt通路激活条件下，在细胞浆中聚集后入核亦发挥转录活化作用。二者均可以通过调节下游增殖、侵袭和凋亡相关因子的转录和表达而调控肿瘤细胞的恶性生物学行为。我们证实了YAP阳性表达主要定位于细胞核，而β-catenin主要定位于细胞膜。二者在卵巢癌中的阳性表达率均高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织。在探讨YAP和β-catenin在卵巢癌中高表达的临床意义时，我们分析了二者过表达与卵巢癌临床病理因素的关系即年龄、组织类型、FIGO分期、分化程度和淋巴转移，结果发现二者均与FIGO分期有关(Ⅲ+Ⅳ期中的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期)。其中YAP的过表达与卵巢癌淋巴结转移有关，β-catenin的过表达与分化程度有关。

已有研究显示，YAP和β-catenin定位于细胞核时能够协同发挥转录活化的作用进而促进恶性肿瘤的发生发展。Hippo 信号通路活的激活能够抑制Wnt信号通路，而Wnt信号通路的激活亦能抑制Hippo 信号通路的活性。在肠癌中Hippo 信号通路活性下调而Wnt信号通路活性上调，磷酸化YAP能够促进β-catenin定位于细胞浆[12]。在胶质瘤中，YAP可以通过GSK3β调节β-catenin的表达进而影响肿瘤的增殖，β-catenin亦能调节YAP。在肝癌中[13]，Wnt/β-catenin信号通路异常激活时，发现YAP亦起到关键促癌因子作用[14]。值得一提的是，我们在本研究中证实了YAP1 和β-catenin 在卵巢癌中高表达且二者表达呈正相关性，这与上述研究报道结果一致。提示我们YAP和β-catenin在卵巢癌中亦发挥协同促进癌症恶性进展的作用，为进一步阐明Hippo 与Wnt 信号通路在卵巢癌的协同作用提供实验基础。但是，二者是如何发挥协同作用，仍需进一步研究证实。

综上所述，YAP和β-catenin 分别作为Hippo和Wnt 信号通路中的关键分子在卵巢癌中高表达，并且均与临床FIGO分期有关，重要的是二者表达呈正常相关。我们的研究证实了YAP和β-catenin在卵巢癌中的协同促癌作用，为探讨卵巢癌发病分子机制提供理论研究基础，为临床卵巢癌早期诊治提供依据。