加味小陷胸汤基于核因子-κB信号通路对非小细胞肺癌荷瘤小鼠的影响实验研究

郑 阳，宿 濛，陈 涛，王永鹏

(1.辽宁省肿瘤医院检验科，辽宁 沈阳 110000；2.辽宁省肿瘤医院消化科，辽宁 沈阳 110000；3.辽宁省肿瘤医院结直肠外科，辽宁 沈阳 110000)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)包括鳞状细胞癌、腺癌以及大细胞癌，占所有肺癌的85%左右[1]，是临床最常见的肺癌病理类型。流行病学资料显示，全球每年有约160万新发肺癌患者，发病标化率约为36.09/10万，我国属于肺癌的高发地区，发病标化率为36.19/10万[2-3]，而且近年来随着环境恶化、生活压力增大等发病率不断增加，造成沉重的社会负担。相较于小细胞肺癌，NSCLC的恶性程度稍低，但是75%的患者确诊时已经处于中晚期，失去了手术治疗时机，化疗、放疗、免疫治疗、分子靶向治疗等虽然能一定程度上让患者获益，但不良反应明显，临床疗效仍不理想[4]，探索新的有效的药物是NSCLC研究的重点。目前研究发现[5]，中药复方在NSCLC中有多靶点的作用，不仅能缓解症状、提高患者生活质量，还在抗复发转移、延长生存期方面有一定效果，故受到越来越多的关注。本次研究即主要探讨中药复方加味小陷胸汤基于核因子-κB(NF-κB)信号通路对NSCLC荷瘤小鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象：SPF级健康C57BL/6小鼠[由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，动物许可证号：SCXK(京)2014-0011]75只，均为雄性，周龄为7～8周，体重20～24 g，平均(22.05±1.13)g。所有小鼠置于恒温21～22 ℃，恒湿55%～65%，安静通风的动物饲养室内进行适应性饲养，时间为5 d期间饲以标准饲料和蒸馏水。

1.1.2 主要材料、药品与试剂：人非小细胞肺癌A549细胞株，品牌：ATCC，购自北京中原公司。加味小陷胸汤，药物组成：黄连、姜半夏、瓜蒌、守宫、三七、大黄、白花蛇舌草、人参、白术、薏苡仁，药物购自北京中医药大学第一附属医院，上述药物中守宫研末，人参另煎，其余药物加水浸泡60 min，采用煎药机后进行2次煎煮、浓缩，按比例加入守宫末、人参药液混匀，制成生药浓度为8、16 g/ml的加味小陷胸汤药液，置于4 ℃冰箱保存；注射用顺铂，规格：每支10 mg，生产批号：20180321，齐鲁制药有限公司生产，使用时用无菌生理盐水配制成浓度为0.4 mg/ml的顺铂溶液，现用现配。流式细胞凋亡检测试剂盒(双染色)，购自杭州倍沃医学科技有限公司；即用型SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色液，购自武汉纯度生物科技有限公司；组织蛋白裂解液，购自齐一生物科技(上海)有限公司；兔抗小鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、核因子-κB(NF-κB)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(灌胃G-HRP)，购自上海恒斐生物科技有限公司；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒，购自长沙达尔锋生物科技有限公司；ECL发光液，购自北京欣华绿源科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备：5920R型离心机，德国Eppendorf公司生产；FACSCalibur型流式细胞仪，美国BD公司生产；DM500型光学显微镜，德国Leica公司生产；E-Gel Imager凝胶成像仪、Fisher Biotech型电泳仪，美国Thermo Fisher Scientific公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及实验方法[6]:取出非小细胞肺癌A549细胞株解冻、复苏，接种于DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，待其生长至对数生长期，采用0.25%胰蛋白酶进行消化，以1200 r/min速度离心10 min，用无菌PBS重悬细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/ml。将所有小鼠编号，随机分为对照组15只和造模组60只。小鼠右侧腋下消毒，造模组予以单细胞悬液0.2 ml皮下接种，对照组予以无菌生理盐水0.2 ml皮下注射；继续饲养小鼠，待皮下结节长径生长至8 mm左右，即为成功建立非小细胞肺癌荷瘤模型，本研究中造模组所有小鼠均造模成功。

将造模成功的小鼠随机分为模型组、加味小陷胸汤低、高浓度组和顺铂组，各15只。模型组和对照组分别予以无菌生理盐水5 ml/kg，腹腔注射，1次/d+蒸馏水5 ml/kg，灌胃，1次/d；加味小陷胸汤低、高浓度组分别予以无菌生理盐水5 ml/kg，腹腔注射，1次/d+8、16 mg/ml加味小陷胸汤药液5 ml/kg，灌胃，1次/d；顺铂组予以0.4 mg/ml顺铂溶液5 ml/kg ，腹腔注射，1次/d +蒸馏水5 ml/kg，灌胃，1次/d。所有小鼠均连续给药14 d。

1.2.2 标本采集与处理[7]：末次给药次日，采用游标卡尺测量肿瘤组织长径(X)及短径(Y)，然后脱颈椎处死小鼠，完整取出肿瘤组织称重，取1/3肿瘤组织(对照组正常组织)用4 %多聚甲醛固定24 h，流水冲洗，依次经70%、80%、90%、100%、100%乙醇脱水及二甲苯透明后，用石蜡包埋，切片机切制4 μm切片，60 ℃恒温烤片2 h后，保存于37 ℃温箱内；取1/3肿瘤组织(对照组正常组织)切成3 mm左右碎块，-80 ℃冻存以备蛋白质免疫印迹(Western blot)检测；剩余肿瘤组织(对照组正常组织)立即进行细胞凋亡检测。

1.2.3 肿瘤体积及抑瘤率计算[8]：肿瘤体积=π×X×Y2/6；生长抑瘤率=(1-治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况[9]：用眼科剪将1.2.2中剩余的肿瘤组织剪碎，加入少量生理盐水，过300目尼龙网，以1000 r/min速度离心5 min，取细胞沉淀；采用无菌生理盐水重悬细胞并将浓度调整为1×105个/ml；4 ℃条件下，取细胞悬液1 ml，以1000 r/min速度离心5 min，细胞沉淀采用预冷的PBS重悬，以1000 r/min速度离心10 min后，重复该步骤2次；按照流式细胞凋亡检测试剂盒说明书中的步骤，采用结合缓冲液500 μl重悬细胞并避光反应10 min，之后滴加FITC标记的Annexin V、碘化丙啶各5 μl，4 ℃孵育30 min；采用FACSCalibur型流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.2.5 免疫组化法检测小鼠肿瘤组织Caspase-3蛋白表达水平[9]：取1.2.2中保存的组织切片，按照免疫组化试剂盒说明书中的步骤，将切片脱蜡、水化，用3%过氧化氢处理10 min灭活内源性过氧化物酶；PBS洗片后用正常山羊血清工作液室温封闭15 min；之后用Caspase-3一抗工作液(1∶50稀释)37 ℃孵育切片1 h；PBS洗片后，用生物素标记的二抗工作液(1∶100稀释)室温孵育切片15 min；PBS洗片后，用辣根酶标记的链霉卵白素工作液室温孵育切片15 min；PBS洗片后，用DAB显色液室温显色8 min；自来水洗片后，依次经苏木素染色液复染20 s、1%盐酸酒精分化、自来水返蓝，完成后中性树胶封片。

结果判定：在显微镜下，Caspase-3表达阳性细胞被染成棕黄色。每张切片随机选择5个400倍视野拍照，并用Image-pro Plus图像分析软件分析Caspase-3表达的平均光密度(IOD)值。

1.2.6 Western blot法检测小鼠肿瘤组织NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表达水平[10]：取1.2.2中冻存的组织(对照组等量正常组织)，冰浴研磨匀浆，用组织蛋白裂解液300 μl摇动裂解10 min；加入蛋白酶抑制剂后，4 ℃以15000 r/min速度离心20 min；取上清液与蛋白上样液1∶1体积混匀，然后与2×上样缓冲液混匀，100 ℃加热5 min使蛋白变性，冷却后准备上样；用试剂盒配制SDS-PAGE凝胶并固定在电泳装置上；上样，开始电泳分离蛋白，直至溴酚蓝抵达分离胶底部；取下凝胶转印至硝酸纤维素(NC)膜上；用5 %脱脂奶粉室温封闭NC膜1 h；TBST洗膜后，用NF-κB、Bcl-2、Bax、内参β-actin(1∶500稀释)一抗工作液，室温震荡孵育1 h；TBST洗膜后，用HRP标记山羊抗兔灌胃G二抗(1∶1000稀释)，室温孵育1.5 h；TBST洗膜后，暗室内用ECL发光液使蛋白条带发光，X光胶片曝光、显影、定影后，晾干。

采用E-Gel Imager凝胶成像仪扫描并采集蛋白条带图像，利用Image-pro Plus图像分析软件分析各蛋白条带灰度值，并计算NF-κB、Bcl-2、Bax相对β-actin的表达量。

1.3 统计学方法 所有统计数据均统一整理，采用SPSS 21.0统计学软件包分析，符合正态性的计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肿瘤体积、瘤重和生长抑制率比较 与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肿瘤体积、瘤重较低，且加味小陷胸汤低浓度组高于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，且差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤生长抑制率比较显示，加味小陷胸汤低浓度组低于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1 。

表1 各组小鼠肿瘤体积、瘤重和生长抑制率比较

2.2 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率比较 与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组肿瘤组织细胞凋亡率较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与加味小陷胸汤低浓度组比较，加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，细胞凋亡率低于加味小陷胸汤低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2(图1)。

表2 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡率比较(%)

A:模型组；B:加味小陷胸汤低浓度组；C:加味小陷胸汤高浓度组；D:顺铂组

2.3 各组小鼠肿瘤组织Caspase-3蛋白表达水平比较 免疫组化染色结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肿瘤组织Caspase-3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肿瘤组织Caspase-3蛋白表达水平较高，且加味小陷胸汤低浓度组低于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表3(图2)。

表3 各组小鼠肿瘤组织Caspase-3蛋白表达水平比较(IOD)

A:对照组；B:模型组；C:加味小陷胸汤低浓度组；D:加味小陷胸汤高浓度组；E：顺铂组

2.4 各组小鼠肿瘤组织NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组小鼠肿瘤组织NF-κB、Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肿瘤组织NF-κB、Bcl-2蛋白表达水平较低，且加味小陷胸汤低浓度组高于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肿瘤组织Bax蛋白表达水平较高，且加味小陷胸汤低浓度组低于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4(图3)。

表4 各组小鼠肿瘤组织NF-κB、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

A:对照组;B:模型组;C:加味小陷胸汤低浓度组；D:加味小陷胸汤高浓度组；E:顺铂组

3 讨 论

非小细胞肺癌已经成为威胁人类生命的常见主要疾病之一，近年来随着化疗药物、肿瘤基因、分子生物学等方面研究的不断发展，临床治疗NSCLC的水平也在不断提高，也促使人们将治疗观念由标准化治疗转向个体化、个性化治疗[11]。中医从整体观念出发，讲究辨证论治，曲萌等[12]研究发现，中医药可以通过免疫调节、抑制肿瘤细胞增殖并促进凋亡、抑制血管形成、抑制细胞转移、逆转肿瘤耐药等机制发挥抗肺癌的作用。可见，中医药治疗肺癌具有多环节、多靶点、多途径调控的优点，值得深入研究。

在中医理论中，NSCLC属于“肺壅”“肺积”“肺岩”“息贲”等范畴，其病位在肺，为虚实夹杂之证，素体正气不足，邪毒侵肺，气血阴阳紊乱，脏腑功能失调，热毒、痰、瘀内生，结于胸中，发为本病[13]，治疗上应祛邪、扶正并重。在本次研究中，我们采用加味小陷胸汤对NSCLC荷瘤小鼠模型进行治疗，小陷胸汤出自张仲景的《伤寒论·辨太阳病脉症并治》，属于经典的祛痰剂，常用于治疗痰热互结之结胸证，本次药物在其基础上加味而成，方中黄连大苦大寒，可清热燥湿、泻火解毒，大黄苦寒，能泻热毒、破积滞、行瘀血，白花蛇舌草苦淡寒，有清热解毒、消痛散结之效，三药均可清热解毒逐瘀；姜半夏辛温，能降逆化痰散结，瓜蒌甘寒，可清热涤痰，宽胸散结，二者善祛痰散结；守宫咸寒有小毒，能止咳平喘、解毒通络散结；三七可活血通脉、散瘀止痛；人参、白术、薏苡仁则功在健脾益气、扶正补虚；诸药合用，既可扶助正气，又可奏清热毒、祛痰浊、破瘀结之效。

现代药理研究显示[13-15]，黄连、大黄、白花蛇舌草及其相应的活性成分黄连素、大黄素、白花蛇舌草黄酮苷等，均有较好的抗肿瘤作用。小陷胸汤能够在体外有效阻滞肺癌A549及H1299细胞生长、增殖并降低其转移能力，同时在体内抑制肺癌小鼠异体移植模型肿瘤生长。本研究中小鼠经相应药物处理后，与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肿瘤体积、瘤重较低，肿瘤生长抑制率较高，且加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组改变较为明显，表明加味小陷胸汤能有效抑制人NSCLC细胞荷瘤小鼠肿瘤组织的生长，发挥较好的抗肿瘤作用，而且呈现一定的剂量依赖性，药物浓度越高，作用效果越明显。

细胞凋亡为细胞主动死亡的一种形式，对于维持机体细胞数量的恒定有重要的意义，而肿瘤发生的根本原因就是细胞凋亡与增殖之间的平衡被打破，导致肿瘤细胞无限增殖，所以促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤的重要方向[16]。本次流式细胞术检测结果显示，与模型组比较，各给药组肿瘤组织细胞凋亡率较高，且加味小陷胸汤低浓度组低于加味小陷胸汤高浓度组和顺铂组，提示加味小陷胸汤能明显促进NSCLC肿瘤细胞凋亡，而关于其作用的具体机制，此次我们从NF-κB信号通路方面进行了探讨。NF-κB与肿瘤发生、生长和转移密切相关，具有明显的抑制细胞凋亡的功能。NF-κB抗凋亡的作用主要通过调节靶基因转录来实现，Bcl-2家族即为其下游常见的凋亡相关基因。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，可与线粒体膜上的受体结合，通过刺激细胞色素C释放来诱发细胞凋亡；Bcl-2则属于抗凋亡蛋白，能够结合Bax从而阻止其促凋亡作用[17]。NF-κB活化后可以上调Bcl-2表达，下调Bax表达，从而抑制细胞凋亡，有研究认为[18]，NF-κB在人类肺癌组织和细胞中，NF-κB通常呈异常的不受控制的激活状态，而抑制NF-κB活化可能成为NSCLC治疗的新靶点。

能够在炎症和损伤的诱导下释放，既促进胶原合成，又抑制肺间质细胞外基质降解，抑制TGF-β1有助于阻止肺纤维化[15]。HMGB1属于晚期炎症因子和损伤相关模式分子，在炎症损伤发生后，其被坏死细胞或单核巨噬细胞释放，之后与TLR2结合使之激活；TLR2为促炎症信号级联传导上游的重要分子，在纤维化疾病中活化后，能够促进炎症细胞因子形成，加重血管内皮细胞细胞通透性，使炎症反应扩大。有研究显示，TLR2可以作为纤维化疾病的早期治疗靶点[17]。本研究结果显示，与模型组比较，加味小陷胸汤低、高浓度组及顺铂组小鼠肺组织HMGB1、TLR2蛋白表达水平较低，且加味小陷胸汤低浓度组>顺铂组>加味小陷胸汤高浓度组，表明高浓度加味小陷胸汤能明显降低肺组织HMGB1、TLR2蛋白表达水平，抑制HMGB1/TLR2信号通路活性，这可能是加味小陷胸汤抑制肺纤维化发展的作用机制之一。

综上所述，加味小陷胸汤能剂量依赖性抑制NSCLC荷瘤小鼠肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，其作用可能与抑制NF-κB信号通路，调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达有关。