转化生长因子-β（TGF-β）基因家族在水产养殖中的潜在应用价值

鲁翠云，匡友谊，郑先虎，孙志鹏，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）基因是1978 年在小鼠（Mus musculus）肉瘤病毒转化的细胞株条件培养基中被鉴定出的，后来逐步发现这是一个庞大的基因家族。该家族已发现多个基因，包括TGF-β、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、生长分化因子（growth differentiation factor，GDF）、活化素（Activin）等，可分为两大亚家族即TGF-β/Activin/Nodal（胚胎形态发生素）和BMP/GDF/MIS（穆勒氏抑制物）。TGF-β 基因具有调节细胞生长、参与和促进细胞免疫、肿瘤发生、心肌生长、细胞增殖、骨骼生长平衡等多种功能，是开发药物的理想模型，甚至已成立了专门开发TGF-β 信号通路及相关生物过程有关的药物公司。除了基础研究、医学和药物学等领域涉及这个基因超家族外，近年来农业养殖动物领域也开始重视这个家族的基因参与多种经济性状遗传调控的机制，希望在一些重要经济性状的遗传解析中获得新的突破。根据最新研究结果分析，水产养殖业最关心的几个重要性状如生长、饲料转化率、疾病与免疫、性别分化与调控、肌间刺等都有这个家族基因参与的痕迹。本文简要介绍了TGF-β超家族主要研究进展，分析该家族在阐明养殖鱼类经济性状的遗传机制方面的潜在价值。

1 TGF-β 的基本功能

TGF-β 广泛存在于各种组织中，多种细胞表面具有TGF-β 受体，这使其具有多种功能的生物化学基础，也是能够影响多种经济性状的根本原因。

1.1 炎症与免疫

最早发现TGF-β 具有调节炎症发生和降低炎症的作用。上世纪九十年代前后就已开始探索TGF-β 类药物在消除炎症中的作用[1]。TGF-β 属自蛋白（self-protein），和B-细胞免疫沉默难以获得高滴度抗体，多是用融合蛋白获得高滴度抗体和确定其免疫功能[2]。

在多个TGF-β 成员中，TGF-β1 主要参与免疫能力的调节和炎症的控制，调节免疫细胞的募集、保留、凋亡、分化和增殖，因此可以根据细胞情况来增强或抑制炎症反应，TGF-β1 在感染过程中抑制了CD8+细胞毒性T 细胞的扩增，但同时也促进了促炎性CD4+Th17 细胞和调节性T 细胞的发展,抑制了T 细胞依赖性炎症[3]。TGF-β 参与免疫与炎症还有很多精细的调控机制，已经和继续为人类、畜禽、鱼类的疾病防治提供基础知识。

1.2 生长与细胞增殖

参与生长控制和细胞增殖过程的调控也是TGF-β 早期被发现的主要功能之一，在2000 年之前就已发现这个作用。当时考察发现，TGF-β 超家族中的两个亚家族都有这个功能[4]。近年更深入地认识了TGF-β 参与生长控制的细节。譬如：哺乳动物的肠上皮细胞不断进行翻转，隐窝中的细胞增殖而绒毛中的细胞凋亡；TGF-β 和胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）均参与肠上皮细胞的分裂、分化、粘附、迁移和死亡调节[5]。

TGF-β 超家族中对生长调节功能较大且应用较多的是GDF 亚家族中的肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）及同一信号通路的其他基因。Lee 研究团队在1997 年鉴定到GDF8（Myostatin）基因对小鼠和比利时蓝牛Bos taurus 肌肉的负调控作用[6,7]，后续多个研究证实，肌肉生长抑素具有进化保守性，多种动物敲除实验证实其具有同样的调节肌肉生长的功能，从而开启了利用该基因创制肌肉明显增大的动物新品种的潮流[8]。

MSTN 基因有多种机制调节肌肉生长，一种是与丝氨酸/苏氨酸激酶受体（ActRIIB）结合直接作用于肌细胞，通过减少肌细胞数量和肌纤维数量来控制肌肉的生长；另一种是通过内分泌系统调节全身的肌肉生长[9,10]。内分泌调节是MSTN 调节垂体发育，或者通过调节肝脏产生的胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）来影响肌肉生长，对肌肉生长起负调控作用[11,12]。

1.3 骨细胞平衡

BMP 基因家族中除BMP1 外都属于TGF-β 超家族成员，特征之一是两个亚家族成员的一级序列在核心多肽上有40%以上的同源序列；之二是它们与TGF-β 家族成员在结合受体后基本都是通过SMAD 蛋白达到信号向下传导。

BMP 功能与骨发生、再生或软骨发生有关，是研究骨骼相关疾病的主要靶标通路。这个家族有十几个蛋白，都有促进骨骼发生，也都在胚胎发生过程中起许多关键作用[13]。但每个BMP 起的作用在不同发育时期和不同组织各有特点。如BMP6 可以挽救BMP7 null 突变体中的眼缺陷，而BMP4 不能[14]。BMP 调节骨生长的同时对动物的酮体生长也有明显的调控作用。

1.4 性别决定与性别分化

目前已鉴定多个TGF-β 基因家族中的基因参与鱼类性别的决定和分化，与这个基因超家族的基本功能一致，即可以调控囊胚期细胞的增殖和减少。TGF-β 信号减少了生殖细胞的数量，促进性腺向精巢发育并决定了性别和性腺的分化[15,16]；另一途径是TGF-β 基因家族成员通过抑制芳香化酶的活性决定性别和促进性腺分化[17]。

2 TGF-β 基因家族在鱼类经济性状遗传机制研究中的应用与价值

水产养殖所重视的经济性状多是多基因调控的性状，如生长速度、饲料转化、脂肪代谢等，很难获得与性状对应的生化产物，从遗传连锁角度鉴定这些经济性状相关的遗传位点和QTL 是一种可行的研究策略，借鉴人和模式生物相关性状的研究结果也是一种捷径。下面介绍的研究结果部分来自水产生物，部分来自水产生物能够借鉴的其他生物。

2.1 水产生物TGF-β 基因家族基因的克隆与鉴定

水产生物相关基因的克隆一般根据模式生物鉴定到的新基因，推测可能具有产业应用价值的则跟进克隆。肌肉生长抑制素GDF8（Myostatin）基因可能是较早克隆出的TGF-β 家族中的基因[18]。科学家们相信这个对肌肉形成非常有调控能力的基因将掀起一次农业动物生产的革命。虽然至今这个革命仍没有到来，但持续的研究证明，敲除这个基因能显著改善肌肉质量和数量，对动物肉类生产的巨大推进作用将会到来。

鱼类中TGF-β 超家族各亚类基因基本上与人的数量相近[19]，这也符合该家族基因保守性较高的估计；软体动物门、半索动物门各亚类的基因数量都较少，或是因为还没有克隆或者就是进化缺失。随着高通量测序的进行，会有更多水产生物的TGF-β 超家族各亚类基因被克隆出来。

2.2 生长

鱼类中Myostatin 基因的研究报道很多。早期利用小RNA 干扰技术和蛋白拮抗技术，试图通过降低Myostatin 的表达量达到提高受体鱼的生长速度。闫学春等[20]报道，卵泡抑素（follistatin，Fst）蛋白具有拮抗TGF-β 超家族许多成员的功能，通过直接的转目标基因可抑制肌肉生长抑制素（myostatin）的活性，提高目标鲤Cyprinus carpio 肌肉的生长。还有利用MSTN 通过Crispr/Case9 等基因编辑技术改造养殖鱼类的报告。如Khalil 等[21]报道，用此基因构建的快速生长的基因敲除的沟鲶Ictalurus punctatus，但养殖鱼类这方面的报道很少，尤其是国内几乎没有。畜禽利用肌肉生长抑素的报道特别多，主要原因可能是中国在大动物转基因研究投入较大。虽然与养殖鱼类遇到了同样的转基因产品难以商业化的生物安全管理问题，但有研究经费支持还是能够促进一些研究工作持续开展，中国水产养殖业在这项高技术的研发上遇到了重大危机，主要是经费支持过少。

李胜杰等[22]利用肌内生长抑素基因上的多态标记和IGF1 等标记，筛选出快速生长的大口黑鲈Micropterus salmoides 优异种质，或可作为新品种选育的工具。

2.3 饲料转化

饲料占水产养殖成本的65%以上（成体或亚成体养殖），提高饲料效率能够增加养殖收益，减少水体污染。但是，饲料转化率是一个与生长和代谢相关的综合性状，难以直接获得相关的生化指标和基因，更难确定基因所在的信号通路。本课题组在鲤饲料转化率（feed conversion ratio，FCR）的QTL 区间鉴定出18 个候选基因，其中4 个基因gdf7、smad7、tgfb2 和tgfbr2 集中于TGF-β 信号通路，而gdf7 位于两个种质共享的QTL 区间（qFCRM12 和qF CRH24），分别解释22.3%和33.4%的表型变异，tgfbr2 和Smad7 位于qFCRM16，可解释表型变异率20.9%；tgfb2 位于qFCRM33，可解释表型变异率28.4%。还有一个重要生长相关基因IGF2[23]，在通路上也与TGF-β 相关联。

有关畜禽TGF-β 参与饲料转化已有少量报道。Jing 等[24]对猪Sus scrofa 剩余采食量（residual feed intake，RFI）高、低差异显著的两组样本进行转录组分析，发现TGF-β 通路的基因在两组样品中有显著地差异表达，认为提高TGF-β 通路的基因表达水平能够提高猪饲料效率；Liu 等[25]在肉鸡Gallus gallus RFI 高、低两组样本的转录组分析中发现，TGF-β 信号通路的基因具有显著表达差异，可以作为饲料效率的候选基因。Jin 等[26]从TGF-β3 基因中筛选到与鸡FCR 显著相关的SNP 标记。该基因位于鸡与FCR 紧密连锁的QTL 区间附近，后续的研究从TGF-β3 及其受体基因中鉴定到nsSNP 和SNVs 标记均对鸡的FCR 具有显著贡献[27,28]。对基因功能的分析发现，TGFBR3 基因与TGFBR2 有协同表达的特征。

2.4 脂肪沉积与代谢

TGF-β 基因超家族参与动物脂肪代谢已确定，但相关机制研究的很少。TGF-β 基因超家族参与动物脂肪代谢的途径之一是：MSTN 抑制Pparγ和Cebpα 表达来抑制3T3-L1 脂肪细胞的分化，通过抑制关键的脂肪酶和促进脂解酶的表达来减少3T3-L1 细胞中脂质的积累，起到调节完全分化的3T3-L1 脂肪细胞中脂肪因子的表达和分泌的作用[29]；MSTN 也可通过将白色脂肪转化为棕色脂肪来调节脂肪的代谢[30]。BMP 亚类在成骨和破骨的骨骼平衡过程中依赖脂肪提供能量，也影响三大类脂肪组织的骨髓脂肪代谢[31]。但Pparγ 的综述中没有涉及肌生长抑素和BMP 对脂肪平衡的影响[32]，这些转录因子在脂肪平衡过程的价值还需进一步探索。

我国已开展多项鱼类脂肪沉积调节的遗传机制，阐明Myostatin 通路与Pparγ 通路的协调脂肪沉积的机制将是重要的研究方向之一。

2.5 性别决定与分化

不像哺乳类动物性别决定机制比较稳定，在遗传水平上性别分化比较清楚。鱼类性别决定机制复杂，一些鱼类受遗传因素大而另一些受环境因素尤其是温度的影响较大，遗传决定也较哺乳类复杂得多[33]。龙娟等[17]总结，至目前已发现有10 种性别基因在不同鱼类中起性别决定的作用，其中如Amhy、Amhr2、Gsdfy 和Gdf6y 等是TGF-β 基因超家族的成员。这些基因所在信号通路除了参与鱼类的性别决定外，还参与鱼类的性别分化等过程。王德寿团队在罗非鱼Oreochromis niloticus 性别决定与性别分化方面做了很多开创性研究并发表多篇论文[34-37]。

2.6 炎症与免疫

这个家族调节肿瘤发生和防治的研究成果在水产养殖上可以借鉴，但水产养殖更关心的是传染性疾病，对非传染性疾病不是很重视，这当然与群体价值高而个体价值低有关。TGF-β 与免疫的相关作用是研究鱼类疾病调控机制的重要方向，发表的文献也多是考虑其免疫作用，目前多处于基因克隆和表达分析阶段[38-40]，未见对具体疾病治疗上的研究报道。

2.7 肌间刺

鲤科鱼类产量大，综合效益比较高，但都有肌间刺这个让消费者烦恼，甚至使小孩子受害的负面性状。肌间刺作为硬骨鱼类进化过程中的遗迹器官[41,42]，缺失后对鱼类的胚胎发育和骨骼发育都没有明显的负面影响[43,44]。因此，减少肌间刺会成为改善鲤科鱼类品质的重要方向之一。推测，TGF-β 超家族的基因，尤其是BMP-SMAD 通路上的某个基因发生突变、或转录与表达过程有较大改变都可能是鲤科等几个科的鱼类具有肌间刺的原因。鉴定具体的基因突变或者转录表达决定机制上的变化是研究这个问题的主要目标。很多科的鱼类具有肌间刺，是所有这些鱼类在同一个通路上的基因产生突变，还是各自在特有的骨形成通路上的基因发生突变也是有意义的科学问题。

3 讨论

3.1 TGF-β 基因超家族的分类

根据信号通路，TGF-β 基因超家族主要分为TGF-β/Activin/Nodal 和BMP/GDF 两个亚家族（表1）。但这个家族基因数和功能不断增多，也有人分为七个和九个亚家族。由于多肽聚合体有同源与异源之分[45]，功能也有多功能和特异性功能的特点，无论从结构上分，还是从功能上分都不是很清晰，而且随着研究的深入，这个家族的成员和功能还会增加，分类会更细。

研究表明，二聚神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）的三维拓扑结构也显示与TGF-β 相似，表明这些生长因子之间存在古老的结构保守性和相近的系统发育关系，这几种信号通路上的蛋白家族或许可结合成为一个更大的超家族[46]。

这个家族受体的数量远少于配体蛋白，但在生物过程的作用很大，受体主要与相关的配体结合包括与不同亚类的配体结合，使调控过程十分复杂，巨大的变异也使这个家族更多地参与经济性状在群体间和个体间的贡献不同，也是经济性状研究的重点（表2）。

3.2 TGF-β 超家族调控是蛋白质调控性状的典型

TGF-β 信号通路从转录到发挥生物学功能的生化过程极其复杂，可以作为了解蛋白调控性状的典型案例，帮助人们深入认识“蛋白质机器”调控经济性状的复杂机制。这个生化过程基本上是：功能基因转录并翻译出多肽类超前体，超前体由400 个左右氨基酸残基组成（per-pro-TGF-β），残基经过生物化学加工，如去掉残基上的信号肽和N 端部分氨基酸残基，形成有生物活性的前体如TGFβ1、GDF8 等，同源配体可聚合成进一步与受体结合的二聚体，即双体如TGFβ1-TGFβ1。一些异源配体间也可聚合并同样会与受体结合如TGFβ1-TGFβ2。一些亚家族间的前体也可形成异源二聚体如Vg1-Nodal。有些实验表明：异源二聚体的活性更强[47]；TGFβ 与受体结合后通过SMAD 蛋白达到信号向下传导的任务即调控靶基因的转录与表达，获得对目标性状调控的结果，如免疫、骨骼生长、细胞增殖、性别决定等。

表1 TGF-β 超家族的基因及基本功能Tab.1 Genes and basic functions in the TGF-β family proteins

这个基因超家族比较复杂重要的原因之一是配体众多，目前已发现40 多个，受体的数量远少于配体的数量。但受体也种类繁多，如TGFβ 亚类有7 个受体，Activin/Inhibin 亚类有6 个受体，至2019年已发现总的受体为13 个[19]，配体与受体间的组合十分复杂，一个二聚体可以和多个受体结合，一个受体也可以和多个配体结合[48]。

表2 TGF-β 超家族蛋白与受体的对应关系Tab.2 The relationship between TGF-β superfamily proteins and receptors

同家族多肽的结构相似性使很多信号通路间可以形成有效的串扰，通路间有相互作用也是多种蛋白信号通路的特征。TGFβ 家族配体和受体都比较多，共享同源序列比例大，更增加了家族内信号串扰的可能性[48,49]。

TGF-β 与其他信号通路相互作用的例子也有，譬如TGF-β 信号通路与GRP-R 之间相互作用。通常，TGF-β 家族中的分子识别通过与多个伙伴的相互作用网络来实现[49,50]；共受体，例如β 聚糖和内皮糖蛋白，也可以在细胞表面被切割，释放其胞外域；释放的果胶保持它们对配体的亲和力，导致配体螯合和信号激活的抑制；协同受体，还提供了协调不同信号通路激活的机会，因此，除TGF-β 外，β 聚糖还可以结合bFGF 并协调调节FGF 和TGF-β 信号传导[47]。这些增加了TGF-β信号通路与其他家族信号串扰的可能性。

3.3 关于TGF-β 基因超家族参与多种经济性状调控的思考

（一）基于TGF-β 基因超家族成员的基本功能。如肌肉生长抑素对生长的调控。这个肌肉生长的负调控因子一旦突变或者敲除，肌肉生长的内源平衡偏向于肌肉快速增加，可获得肌肉组织增大的结果；BMP 对骨骼的调控也直接影响生长；再比如对性别的调控也是基于这个家族的基本功能即对细胞数量的调节能力，这里是调节性腺细胞的数量达到调控性别分化的结果，从而决定性别。

（二）通过调控标靶基因达到调节性状的结果。如调控脂肪沉积的关键基因PPARγ 的转录水平调控脂肪；对饲料转化率调控的细节还不清楚，但全基因组关联分析鉴定到多个TGF-β 基因超家族成员参与了鲤饲料转化效率的提高。

（三）通过调控垂体等全局性功能器官分泌的激素来调控具体的经济性状。如肌肉生长抑素就具有调节垂体激素释放的功能。

TGF-β 基因超家族之所以能参与调控多种经济性状，关键点源于其基本的生物学特征即配体在多种组织中都有表达，多种细胞表面都存在受体，由此他们或是直接参与性状的形成或者通过调节标靶蛋白配体基因表达来达到调节性状的结果。

4 展望

综上所述，TGF-β 代表了分泌性多肽因子的进化保守家族，可调节生理性胚胎发生和成年动物组织稳态的许多方面[51-53]，据此可推断其在动物主要经济性状的调控上也具有重要调节功能。虽然正在越来越多地关注这个基因超家族在畜禽和水产动物中的价值，但目前的研究还是初步和零散的，借助于人及药物的研究成果，畜禽和水产养殖动物的研究和利用会得到快速发展。

由于TGF-β 是在多种器官和组织中表达，与特定组织调控的信号通路结合即调高或者抑制特定性状相关基因的转录或表达，从而参与了该性状的形成。医学研究重点在于疾病形成过程的作用，药物学研究重点是提高某种药物或者减少某种药物来阻止疾病的发展，农业育种工作者则重点在于首先了解这个信号通路如何在特定性状形成过程中发挥了作用，哪些变异使其相关蛋白复合物上调，哪些变异使其下调，从而获得可育种的标记和分子水平的其他工具如设计功能饲料等。