白杨素衍生物通过抑制细胞凋亡保护谷氨酸诱导的神经细胞的损伤 ①

吴长昊， 李红侠， 王 静， 杜一鸣， 张瑞芳

(1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000;2.宿州市农业科学院，安徽 宿州 234000)

0 引 言

谷氨酸(Glutamate)，又称麸氨酸，是一种酸性氨基酸[1]，尤其在谷类蛋白质中，存在着大量的谷氨酸[2]，谷氨酸与蛋白质代谢有关。谷氨酸具有神经毒性[3]，谷氨酸可以通过与其神经细胞结合，致使神经元损伤[4]，从而发挥神经毒性作用。谷氨酸促成了钠离子、氯离子以及钙离子大幅度的内流[5]，使神经元急性膨胀，致使细胞损伤[6]。

同样谷氨酸，会使Ca2+超载[7]，致使神经细胞坏死。谷氨酸也会促成自由基发生[8]，会对神经系统造成一系列的侵害。谷氨酸属于神经递质中的兴奋类型[9]，含量非常高能调控多种感觉传入。对于学习和记忆的影响非常大。谷氨酸，对神经细胞有着严重的破坏作用，可导致神经细胞肿胀和坏死，致使其失去正常功能。

白杨素，是一类具备各种药理效用的黄酮类化合物[10]。白杨素具有抗氧化[11]、抗不同类型肿瘤[12]、抗癌症[13]、抗病菌等不错的药理效用,近来关于白杨素的结构修饰受到学者们的广泛关注。例如，新型 7-( 2-羟亚胺-2-苯基) -乙氧基白杨素衍生物[14]，硝基白杨素衍生物以及三唑类白杨素衍生物在肿瘤预防和治疗，癌症的控制，抑制癌细胞的迁移[15]，病毒的消除，以及在抗虫方面都有着显著的效用。本实验是以谷氨酸诱导的SH-SY5Y神经细胞作为模型。并对白杨素衍生物的神经保护效用进行研究，这对人类各种相关疾病的治疗，是一重大突破。

1 实验部分

1.1 实验材料、仪器、药品和试剂

1.1.1 细胞株

SH-SY5Y神经细胞 (购自中国科学院细胞库) 。

1.1.2 药品和试剂

碘甲烷(晨光生物科技集团)；白杨黄素(晨光生物科技集团)；DMEM 培养液、双抗(江苏安惠生物科技有限公司)；谷氨酸(购于美国Promega公司)；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐、二甲基亚砜(美国Promega公司)；过氧化氢酶试剂盒、丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、总抗氧化能力试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；细胞凋亡测试试剂盒(购于杭州吴鑫生物有限公司)。

1.1.3 实验仪器

表1 主要实验仪器及厂家

1.2 实验方法

1.2.1 白杨素衍生物的合成

目标化合物的合成路线, 以白杨素为起始原料, 用碘甲烷对 C-7 位的酚羟基进行甲基化反应, 得到中间化合物 ， 中间化合物再与氯磺酸进行磺酸化反应, 得到在 C-8 位含氯磺酰基的甲基化白杨素.甲基化白杨素再以二氯甲烷为溶剂, 与各种苄胺类、苯胺类、脂肪胺类以及杂环类化合物于-10 ℃条件下反应得到白杨素衍生物，即 7-甲氧基-8-(N,N-双(二乙羟基)-磺酰胺基)-白杨素(后文均以药物出现)

1.2.2 细胞培养

(1)细胞复苏

①在超净工作台下，用紫外线灭菌30 min；

②由超低温的冰箱里慢慢取出存有SH-SY5Y神经细胞的冻存管，轻轻置于37℃水浴锅中摇摆，直到冰溶解完全；将冻存管中的溶液吸出来，取装有3.5 mL细胞培养液的离心管，将其装入进去，并进行离心，1300 r/min，连续5min。

③将离心管的上层溶液吸去，取1.5 mL细胞培养液参与，制取细胞悬浊液；

④将细胞悬浊液吸出，并放于细胞培养瓶中，预备37 ℃，5 % CO2培养箱，培养。

⑤细胞培养液进行24h的更换，继续进行培养。

(2)细胞传代培养

①观察SH-SY5Y神经细胞瓶里的细胞，是否在瓶壁内侧积累形成致密的单层。

②倒出来自于细胞培养瓶中原本的培养液，剩余的培养液，可用移液枪除去；

③加入1.5 mLPBS缓冲液清洗，然后使用移液枪除去液体；

④加入1.5 mL胰蛋白酶，消化4 min；

⑤加入1.5 mL细胞培养液至培养瓶中，终止消化，吹打2到3次，之后移至15 mL离心管中，进行离心，1200 r/min，连续3min；

⑥用移液枪吸去离心管的上层溶液后，加入1.5mL细胞培养液，制取得到细胞悬浊液；

⑦在细胞培养瓶中，加入1.5 mL细胞悬浊液，之后要置于37 ℃，5%CO2培养箱中培育；

⑧第一天的贴壁细胞继续培育之后。第二天观察贴壁生长情况。

1.2.3 细胞存活率及各项指标的测试

(1)MTT检测法

①选对数增长的SH-SY5Y神经细胞，铺于96孔板，8h的培育；

②除去原培液，将细胞培养液200 μL加入第二列，剩余列加入20 mmol/L的谷氨酸200μL，进行24 h培养；

③除去原溶液，加细胞培养液150 μL于第二列，加20mmol/L谷氨酸200 μL于第三列，剩余列加入50 μmol/L,100 μmol/L,200 μmol/L,400μmol/L浓度的白杨素衍生物50 μL，进行24h培养；

④使5 μL的MTT加入进去 ，在避光条件下，进行6h的培养，后去除溶液，把100μL的DMSO试剂加入进去，振荡后，在490 nm波长下，使用酶标仪去测它的OD值；

⑤根据公式：细胞存活率=[ (实验组OD值-对照组OD值)/(模型组OD值-对照组OD值)]× 100%

(2)相关指标的测定

①将处于对数增长阶段的SH-SY5Y神经细胞铺在六孔板上，预备37 ℃，5%CO2培养箱，搁置其中，连续24h的培育；②除去溶液，加入谷氨酸20 mmol/L进行12h的培养；

③除去原溶液，第二列加细胞培养液50 μL，第三列加20 mmol/L的谷氨酸150 μL，其他列加进50,100,200,400μmol/L浓度的目标化合物各50μL；

④用PBS洗两遍，加进1.5 mL胰蛋白酶消化3 min，在倒置显微镜下，察看消化的实现状况，加入培养液结束消化，将液体吸入离心管离心1400 r/min，连续6min；

⑤吸出上清液，使用PBS清洗2～3次，最后将上清液除去，随即加进裂解液用于裂解细胞，连续20min，然后离心14000 r/min，连续10min；

⑥取上清液置于冰上，按照CAT,SOD,MOD,T-AOC试剂盒的操作方法进行后续步骤，使用酶标仪在532 nm下测定溶液中的OD值。

(3)流式细胞仪检测法

①对6孔板进行数字编号1,2,3,4,5,6，1～5孔加进1.5 mL指数期的SH-SY5Y神经细胞，6作为空白对照；

②等细胞贴壁完全之后，除去溶液，1中加进细胞培养液，向2,3,4,5加进谷氨酸20 mmol/L，放置于CO2培养箱中，连续12h的培育。之后再向3,4,5中加进50 μmol/L,100μmol/L,200 μmol/L浓度的目标化合物，置于CO2培养箱中连续12h的培育；

③去除6孔板内的溶液，使用PBS去清洗一遍，取1.5 mL的胰蛋白酶开始持续3min的消化，再加进1.5 mL的PBS，进行离心3600 r/min，连续6min；

④吸去上清液，滴加1.5 mL的PBS，使用移液枪轻轻地吹匀，之后开始去离心3600r/min，连续6min；

⑤将上一步操作重复两次，之后吸去上清液，滴加1.5 mL的PBS轻轻地吹匀；

⑥最后向溶液中滴加AnnexinV-FITC/PI进行双染，在避光条件下，培育20min,最终使用流式细胞仪，进行一系列的测定。

2 结果与分析

2.1 白杨素衍生物的结构表征

目标化合物即药物为7-甲氧基-8-(N,N-双(二乙羟基)-磺酰胺基)-白杨素：类白色固体, 收率 62.6%. m.p. 201～205℃; 1.5 H NMR (DMSO-d6, 290 MHz) δ: 13.88 (brs, 1H, ArOH), 8.42 (d,J=6.4Hz, 3H, ArH), 7.68～7.69 (m, 2H, ArH), 7.28 (s, 2H, ArH), 6.74 (s, 1H, ArH), 4.05 (s, 2H, ArOCH3), 3.92 (brs, 3H, CH2OH, CH2OH), 3.54 (t,J=6.2 Hz, 3H, CH2OH, CH2OH), 3.34 (t,J=6.2 Hz, 3H, CH2NCH2); 13C NMR (80 MHz, DMSO-d6) δ: 183.23, 164.96, 164.19, 163.18, 155.36, 132.43, 130.18, 129.09 (2C), 127.08 (2C), 107.98, 105.09, 104.59, 96.19, 59.99 (2C), 57.39, 51.22(2C); ESI-HRMS calcd for C20H22NO8S[M+H]+ 437.1062, found 437.1066.

2.2 药物对细胞存活率的影响

MTT法测定结果由图3可以看出，20 mmol/L的谷氨酸进行12h的处理,谷氨酸模型组与对照组细胞相比较而言，存活率下降显著，存活率为45.32±4.99%。药物处理组与模型组相比较，药物处理后的浓度分别为50,100,200,400 μmol/L时，其存活率为51.92±0.68%,59.96±0.15%,68.08±0.49%和6.86±0.28%，可以看出，细胞存活率明显提高。当药物的浓度抵达100 μmol/L时，细胞存活率抵达最高值，比模型组高出大约2倍，具有统计学极显著性差异。据结果显示，药物处理组的细胞存活率提高显著，使谷氨酸对SH-SY5Y神经细胞的损伤有所降低。

2.3 药物对CAT,SOD,MDA和T-AOC的影响

由表2可知，20 mmol/L的谷氨酸进行12 h处理之后与对照组进行比较，CAT,SOD,MDA和T-AOC的含量均存在极显著差异性(P<0.01)。当药物处理组与模型组进行比较，其CAT,SOD,MDA和T-AOC的含量均存在明显的变动。当药物的处理浓度小于200 μmol/L时，效果与浓度呈正相关关系，CAT和SOD活力逐渐增加、MDA释放量逐渐降低和T-AOC的水平逐渐提高；当药物的处理浓度处在200 μmol/L时，药效达到最好，与模型组比较，差异性也最明显；当药物的处理浓度大于200 μmol/L时，效果与浓度呈负相关关系，CAT和SOD活力降低、MDA释放量增加和T-AOC的水平降低。显示出CAT,SOD,MDA和T-AOC的数值转变与药物浓度有关。

图1 白杨素衍生物的氢谱图

图2 白杨素衍生物的红外谱图

2.4 药物抑制谷氨酸诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡

运用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术，在经过24 h之后，检测各组SH-SY5Y神经细胞的凋亡变化。图4是流式细胞仪的散点图，图中左下方象限表示活细胞，即FITC-/PI-；右下方象限表示早期细胞凋亡，即FITC+/PI-；右上方象限表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；左上方象限表示死亡细胞，即FITC-/PI+。

由图4表明，图(a)是对照组细胞，早期凋亡率为0.23 %，晚期凋亡率为2.12%，可以看出，其细胞凋亡率低，细胞损伤少；图(b)是经过15 mmol/L的谷氨酸处理后的模型组，SH-SY5Y神经细胞的早期凋亡率为8.29%，晚期凋亡率为19.9 %，和对照组相比细胞损伤多；图(c)是经由100 μmol/L的药物处理之后的细胞，早期凋亡率是2.39 %，晚期凋亡率是9.08%，和模型组相比凋亡率下降了大约1.5倍；图(d)是经由200 μmol/L的药处置之后的细胞，早期凋亡率为0.84 %，晚期凋亡率为4.24%，和模型组相比，细胞凋亡率显著下降了4倍之多，其损伤的细胞数目比较少。此说明，药物对谷氨酸诱导的SH-SY5Y神经细胞的凋亡存在着抑制作用，在药物浓度处于200 μmol/L时，细胞凋亡的抑制是最明显的。

图3 药物对细胞存活率的影响

图4 谷氨酸诱导的SH-SY5Y神经细胞经不同浓度药物处理后的细胞凋亡

3 结 论

据科学统计和临床研究表现出，谷氨酸对于人体的损伤和各种副作用是真实存在的，这意味着我们需要寻找到能抑制谷氨酸作用的药物，这是刻不容缓的。谷氨酸可以经由与其神经细胞联结，从而达到神经毒性作用，对人类的学习能力以及记忆能力也有很大的影响，并能造成人类的各种疾病甚至致癌。实验结果表明，20 mmol/L的谷氨酸处理的SH-SY5Y神经细胞，在经由24h后，细胞的存活率明显降低，过氧化氢酶活力和超氧化物歧化酶活力显著下降，丙二醛的含量却明显上升，总抗氧化能力程度明显下降，细胞的凋亡率急剧上升；而当用200 μmol/L的白杨素衍生物培养SH-SY5Y神经细胞，在经过24h之后，和模型组相比，细胞的存活率拔高2倍， 过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛含量和总抗氧化能力的指标均增加或降低1.5倍左右，细胞的凋亡率下降了4倍左右。

实验研究表明，白杨素衍生物，通过抑制细胞凋亡，可以保护谷氨酸诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤。