非洲猪瘟的流行病学和疫苗研究最新进展

刘 芳，孙海娟，王建国，宋艳萍

（1.山东省威海市环翠区温泉畜牧兽医中心站，山东 威海 264200；2.山东省威海市环翠区动物疫病预防控制中心，山东 威海）

ASFV 是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，其拥有庞大的双链DNA 基因组，包含从170～190 kb 大小不等的毒株，编码了超过150 种蛋白质，仅仅从病毒体中被鉴定出来的结构蛋白就多达68 种，许多蛋白质仍未被鉴定出来。正是由于ASFV 极其复杂，以及对其毒力因子及其相关保护性的了解太少，至今仍未研制出针对ASFV 的安全有效的疫苗[1]。

ASF 严重危害生猪养殖业，目前控制ASF的办法是隔离和扑杀受影响地区的动物。接种疫苗是阻止疫病蔓延的重要手段，研制ASF 疫苗是当务之急。本文对ASF 的流行病学和疫苗研究的最新进展加以综述，为后续疫苗研发提供参考和依据。

1 ASF 流行病学

ASFV 具有高度传染性和稳定性，健康猪可以通过直接接触感染的猪或被病毒污染的垫草、饲料、饮水等感染，也可通过软蜱等媒介昆虫叮咬而感染。ASFV 发现于非洲，在软蜱、疣猪和野猪之间维持着丛林传播循环，这些动物并不因感染ASFV 而患病。然而，ASFV 在家猪和野猪之间传播，却会造成极高的致病率和致死率。ASFV 在非洲的流行，首次记录于20 世纪初。1957 年，ASFV 出现在非洲以外的葡萄牙，随后从20 世纪60 年代到80 年代蔓延到西欧。在20世纪70 年代至80 年代初期，ASFV 出现在加勒比群岛和巴西。到90 年代中期，除了自1982 年以来一直流行ASFV 的撒丁岛除外，美洲和欧洲已消除ASFV[2]。2007 年，ASFV 传入到高加索地区，并迅速传播到东欧，然后继续蔓延。随后，ASFV 在远至比利时西部的野猪中被发现。目前，ASFV 正在我国的家猪中传播，并已蔓延至周边国家，包括蒙古、越南、柬埔寨、老挝和朝鲜[3]。ASFV 目前有24 种基于主要衣壳蛋白p72 的基因型，以及基于病毒血凝素CD2 样蛋白（CD2v）和C 型凝集素的8 种血清型[4]。在我国传播的病毒已经被鉴定为高致病性的基因II 型毒株。

2 疫苗研究进展

2.1 灭活疫苗

灭活疫苗具备制备工艺简单、价格便宜等优势，因此是疫苗研制的首选工艺，ASF 疫情暴发后，最先开始研究的是灭活疫苗，但灭活疫苗诱导的免疫应答弱而且很难诱导产生有效的中和抗体，无法对ASFV 的感染起到保护作用。

2.2 减毒活疫苗

自然致弱活疫苗ASFV 可以通过细胞传代培养使毒力减弱，但经多次传代培养后的毒株失去了保护性免疫抗原，无法诱导有效的免疫应答。经猪骨髓细胞传代培养获得的弱毒株在西班牙和葡萄牙进行田间试验，免疫猪群出现很多慢性或持续性ASFV 感染，产生严重副作用。自然致弱毒株 OURT88/3 和NH/P68 免疫猪群后可获得抗亲代毒株的100 % 免疫保护率，以及抗不同基因型ASFV 的66 %～100 % 交叉保护率。但自然致弱ASF 疫苗安全性问题堪忧，副作用多，且有毒力返强的可能，这在一定程度上阻碍了其作为商品化疫苗的发展。

重组致弱活疫苗敲除 ASFV TK、UK、9GL、EP402R、NL 或MCF 360/55 基因，可使ASFV 毒力减弱且具有较好的免疫原性，用此方法制备的重组致弱活疫苗对猪群进行免疫，可以不同程度抵御来自同源或异源ASFV 毒株的感染。我国哈兽研正研制的七基因缺失疫苗，已初步证明其具有一定的安全性和有效性[5]。若进一步确定ASFV 毒力关键基因，实现对目标毒力基因进行敲除或修改，找到稳定的生产细胞系，重组致弱活疫苗将有望制备成我国首个商品化ASF疫苗[6]。

2.3 亚单位疫苗

最早证明可以抵抗ASFV 攻击的重组ASFV蛋白是杆状病毒表达的ASFV 血凝素（HA）蛋白，CD2v[7]。CD2v 不是强免疫原性抗原，需要大剂量的蛋白质才能诱导较好的免疫保护作用。ASFV p54 和p30 分别参与病毒的附着和内化，它们都能诱导机体产生中和抗体。单独用p54 或p30 抗原免疫猪，可诱导免疫的猪产生中和抗体，但无法阻止免疫猪群的感染死亡。用p54 和p30 联合免疫的猪，出现临床症状延缓，病毒血症减少的现象，部分猪受到保护免受E75 株强毒的攻击。同样用杆状病毒表达的p54/p30 融合蛋白免疫的猪也可减少病毒血症，同时保护所有猪免受E75 的致命攻击。

用杆状病毒表达蛋白p30+p54+p72+p22的混合物免疫的猪，对ASFV Pr4Ⅰ毒株的同源毒株的攻击没有保护作用，表明这些蛋白诱导的中和抗体不足以起到保护作用。早期重组CD2v的研究同样支持这一结论，在没有中和抗体的情况下产生了保护作用，这表明，中和抗体以外的因素在ASFV 保护中产生了作用。Oura 的试验结果显示，用减毒ASFV 株免疫去除了CD8+T 细胞的猪受到了同源毒株的攻击，而未去除CD8+T细胞的猪则受到了保护，这证实了细胞介导的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）免疫应答对抵抗ASFV 攻击的重要作用[8]，该项研究表明，除了抗体外还需要一种能够刺激T 细胞介导的免疫反应的疫苗来抵抗ASFV 的感染。

2.4 DNA 疫苗

DNA 疫苗与亚单位疫苗相比，能够诱导CTL 免疫应答，对抵抗ASFV 的感染具有重要的保护作用[9]。同ASFV 亚单位疫苗制剂一样，DNA 疫苗途径的靶抗原也是p54 和p30。使用编码p54/p30 融合蛋白的质粒DNA 疫苗免疫猪，既不产生中和抗体，也不产生T 细胞反应，对ASFV 攻击没有保护作用[10]。用编码猪白细胞抗原的SLAⅡ与p54/p30 融合的DNA 疫苗免疫猪，可产生广泛的免疫应答，包括特异性抗体和T 细胞，但没有保护猪免受ASFV 的攻击。将ASFV 血凝素蛋白CD2v（称为sHA）融合到p54/p30 嵌合体上[11]，用sHA/p54/p30 融合体对猪进行免疫，确实诱导了抗原特异性的B 细胞和T 细胞免疫反应，但没有保护作用。然而在sHA/p54/p30 融合构建体中加入泛素对猪进行免疫接种，可诱导免疫猪群产生强烈的细胞免疫，并保护其免受ASFV 的攻击，在缺乏可检测到的中和抗体的情况下，存活率与T 细胞的存在具有相关性，进一步支持了CTLs 在抗ASFV 中具有重要作用。

建立的为识别ASFV 保护性免疫中T 细胞靶点的DNA 表达文库，再次证明CTL 反应在抗ASFV 中的具有重要作用[12]。该文由80 个基于I型 Ba71v A 毒株的SFV 开放阅读框组成，与泛素融合，约占 ASFV 编码蛋白质的一半。用DNA 文库免疫猪，可使60 % 的猪免受致死性强毒株E75 的攻击。免疫猪体内未检测到特异性抗ASFV 的抗体，但在攻毒后可检测到ASFV 特异性T 细胞。

2.5 病毒载体疫苗

使用病毒载体是诱导特异性免疫及非特异性免疫的另一种疫苗方法。通过去除或使用免疫原替换病毒毒力基因，或使病毒载体无法复制来保障疫苗的安全性。同时，病毒载体疫苗可区分自然感染动物和疫苗接种动物，即编码免疫原的病毒载体可以作为疫苗标记。迄今为止，在猪身上已经评估了几种基于载体的方法，但很少有针对ASFV 强毒株攻毒的试验。

构建表达ASFV p30、p54、p72 的质粒型甲病毒复制子载体系统来免疫猪。表达p30 的甲病毒免疫接种的猪产生高水平的p30 抗体，用p30免疫的猪血清中和病毒呈现阳性，提示中和活性水平偏低。表达p54 的甲病毒免疫接种猪产生低水平的抗p54 抗体，表达p72 甲病毒免疫猪血清未检测到抗原特异性抗体。但将CD2v 的sHA 结构域加入p72 确实产生了可检测水平的抗p72 抗体。各抗原在体外的表达水平与产生的免疫应答相关。遗憾的是，这项研究没有包括细胞介导的免疫反应的数据，也未进行猪群攻毒保护试验[13]。

用病毒载体递呈抗原混合物免疫接种猪后，对其免疫原性进行研究。腺病毒递送的ASFV 抗原p30+p54+p72+pp62，ASFV 基因A151R+B119 L+B602L+EP402R+PRR+B438L+K205R+A104R同时诱导高水平的抗原特异性体液免疫和细胞免疫应答[14]。另一种ASF 疫苗是由改良的痘苗病毒安卡拉载体递送的ASFV 抗原p72、CD2v 和C型凝集素[15]。虽然没有诱导表达抗原特异性抗体，但在免疫猪体内检测到了每一种抗原的T 细胞反应。然而，这些免疫研究都没有完整的猪群攻毒保护试验数据，免疫效果有待验证。

3 小结

ASF 对全球的养猪行业造成严重影响，针对ASF 的多种疫苗策略已被研究，诱导产生中和抗体及CTL 反应是ASF 疫苗设计的重要内容，许多策略需要进一步进行猪群攻毒保护试验。目前来看，减毒活疫苗可以提供抵抗ASFV 的免疫保护，但却有较多副作用，安全性有待提高，需要确定ASFV 毒力基因以准确对病毒基因进行改造，其次，找到稳定的生产细胞系也是减毒活疫苗作为ASF 商品化疫苗生产需要解决的一个重要问题。亚单位疫苗和DNA 疫苗采用靶向方法，副作用小，安全性高，但研究者至今仍不清楚在毒理和免疫病理学或保护中发挥作用的ASFV 靶点有哪些，加深对ASFV 单个蛋白质和蛋白质组功能的理解，对于合理设计靶向疫苗非常重要。