不同类型过敏性结膜炎患儿TSLP、TGF-β1及ECP表达及临床意义

江灵

过敏性结膜炎（Allergic conjunctivitis，AC）是由结膜（也包括角膜）组织对外界变应原产生的超敏反应，主要由Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应介导。当变应原首次接触机体，机体接受刺激产生以IgE 为主的抗体［1］。当变应原再次接触后，已致敏的肥大细胞表面IgE 与变应原结合，引起肥大细胞脱颗粒并释放大量介质。除了肥大细胞，嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞等多种血液和免疫细胞参与AC 的发病过程。常见的AC 有三种不同类型：季节性过敏性结膜炎（seasonal allergic conjunctivitis，SAC）、常年性过敏性结膜炎（perennial allergic conjunctivitis，PAC）和春季角结膜炎（vernal keratoconjunctivitis，VKC）。胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一种上皮细胞分泌的细胞因子，在超敏反应局部表达增加［2］。人转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一种是激素样多肽，在炎症、细胞增殖、免疫调节等方面起重要作用［3］。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）是嗜酸性粒细胞分泌的毒性颗粒蛋白，在炎症和过敏性疾病的致病过程中发挥重要功能［4］。目前临床上AC 的实验室检查主要以泪液IgE 定量分析、结膜分泌物涂片和刮片检查为主，但均存在敏感性和特异性不高的问题。因此，寻找新的可替代的评价分子尤为重要。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年1月由本院眼科收治的诊断为过敏性结膜炎儿童患者60 例，根据过敏性结膜炎分型不同分为3 组：季节性过敏性结膜炎组（SAC 组）19 例、常年性过敏性结膜炎组（PAC组）18 例和春季角结膜炎组（VKC 组）23 例。另外选择年龄相似的健康儿童20 例作为正常对照组。本研究经院伦理委员会审批通过，所有受试者及其监护人均知情并签署知情同意书。

纳入标准：①符合上述过敏性结膜炎诊断标准［1］；②年龄未满14 周岁。排除标准：①有荨麻疹、湿疹、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等全身变态反应性疾病史者；②有其他角膜、结膜、巩膜疾病史者；③有隐形眼镜配戴史者；④眼部有手术病史者；⑤近半年眼部有用药史者。

1.2 研究方法

1.2.1 泪液中细胞因子的检测

受试患者取坐位，微仰头并向鼻上注视，研究者使用10 μL 医用一次性自吸式微量吸管在下睑颞侧睑缘处采集泪液，双眼各取5 μL，共计10 μL。EP 管分装储存在-80℃低温冰箱中，待全部样本采集完毕后行进一步分析。泪液中TSLP、TGF-β1 及ECP 细胞因子的测定采用liquichip 液相芯片技术，检测操作由天津生物芯片技术有限责任公司完成。

1.2.2 血清中细胞因子的检测

受试患者空腹抽取外周静脉血5 mL 于肝素抗凝管内，室温静置1 h 后以3 000 r/min 转速离心5 min，取上清液分装至EP 管并储存在-80℃低温冰箱中，待全部样本采集完毕后行进一步分析。血清TSLP、TGF-β1 及ECP 细胞因子的检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）技术，TSLP 和TGF-β1 检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，ECP 检测试剂盒由上海西唐生物科技有限公司。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测结膜上皮细胞中细胞因子表达

受试者双眼用盐酸丙美卡因滴眼液（比利时爱尔康公司，进口药品注册证号：H20090082）点滴2 次行眼表面麻醉，每次间隔3 min。无菌显微镊夹取已消毒的硝酸纤维膜轻敷于受试者眼侧、球结膜上下部10 s 后，迅速转移至盛有350 μL 1%的β-巯基乙醇RLT 缓冲液的洁净EP 管中，双眼样本采集后合并于-80℃低温冰箱中储存，待全部样本采集完毕后行进一步分析。待样本收集完整后，根据试剂盒步骤要求提取结膜上皮细胞总RNA，转录成cDNA，行实时荧光定量PCR。检测以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCt法分析TSLP、TGF-β1及ECP mRNA 相对表达量。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，40 个循环；72℃充分延伸5 min。

1.3 治疗方法

采用0.1%盐酸奥洛他定滴眼液（5 mL：5 mg，Alcon 公司，进口药品注册证号：H20130954）对三组不同型别的过敏性结膜炎的60 例患者进行治疗，1～2 d/12 h，局部点眼，连续使用两周，如两周仍有症状，继续治疗至症状完全消失。停药3日后测定泪液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 的水平并与治疗前的数据进行比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间差异采用方差分析，两组间比较采用t检验。计数资料用n（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组受试者一般资料

所有组别受试者年龄、性别比例、平均病程、严重程度等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 不同组别一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general information in different groups（±s）

表1 不同组别一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general information in different groups（±s）

组别SAC 组PAC 组VKC 组正常对照组χ2/F 值P 值n 19 18 23 20年龄6.5±1.6 6.7±2.5 7.3±2.2 7.0±1.9 0.59 0.62男/女9/10 10/8 11/12 11/9 0.47 0.93平均病程（月）5.24±1.9 5.36±1.7 5.71±2.4-0.30 0.74轻/中/重4/9/6 4/10/4 6/12/5-1.23 0.87

2.2 各组受试者泪液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平

三种类型过敏性结膜炎组受试者泪液和血清中TSLP 和ECP 水平明显高于正常对照组，TGF-β1水平明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。VKC 组泪液TSLP，血清TSLP 和ECP 水平明显高于其他两组，PAC 组泪液ECP 水平明显高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组受试者泪液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平的比较（±s）Table 2 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of subjects in each group（±s）

表2 各组受试者泪液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平的比较（±s）Table 2 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of subjects in each group（±s）

组别SAC 组PAC 组VKC 组正常对照组F 值P 值n 泪液血清19 18 23 20 TSLP（pg/mL）27.74±5.28 33.25±8.12 46.32±7.20 7.32±2.57 146.03＜0.05 TGF-β1（pg/mL）22.11±5.91 23.34±6.19 21.64±5.52 48.59±7.42 87.91＜0.05 ECP（ng/mL）31.28±4.96 42.45±8.75 33.36±6.48 3.65±1.31 154.42＜0.05 TSLP（pg/mL）17.93±2.34 19.41±2.75 24.12±3.01 4.24±1.54 243.54＜0.05 TGF-β1（pg/mL）12.57±5.45 12.24±5.19 10.21±4.73 25.36±5.42 46.09＜0.05 ECP（ng/mL）15.24±2.64 14.73±3.21 18.53±3.86 3.13±1.24 107.93＜0.05

2.3 各组受试者结膜上皮细胞中TSLP、TGF-β1和ECP mRNA 表达水平

4 组受试者结膜上皮细胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表达水平比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与正常对照组比较，SAC 组、PAC 组和VKC 组结膜上皮细胞中TSLP 和ECP mRNA 表达明显增加，TGF-β1 表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。VKC 组TSLP 和ECP mRNA表达水平明显高于SAC 组和PAC 组，TGF-β1 mRNA 表达水平明显低于另两组，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.4 治疗前后泪液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平变化

60 例不同组别过敏性结膜炎患者治疗前后对泪液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平进行比较，结果如图1所示。治疗后的泪液和血清中TSLP 和ECP 水平较治疗前明显减低，TGF-β1 水平较治疗前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组受试者结膜上皮细胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP mRNA expression levels in Conjunctival epithelial cells（±s）

表3 各组受试者结膜上皮细胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表达水平的比较（±s）Table 3 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP mRNA expression levels in Conjunctival epithelial cells（±s）

组别SAC 组PAC 组VKC 组正常对照组F 值P 值n 19 18 23 20 TSLP 3.60±1.54 2.57±0.68 7.21±2.87 1.00±0.00 49.42＜0.05 TGF-β1 0.68±0.20 0.65±0.19 0.47±0.13 1.00±0.00 45.53＜0.05 ECP 3.19±1.08 3.42±1.27 6.89±3.13 1.00±0.00 37.04＜0.05

3 讨论

过敏性结膜炎（AC）是一种常见的眼科眼表疾病，全球约有五分之一的人曾患AC［5］。有报道显示，美国有40%人群有AC 病史，但就医人数仅有10%［6］。大约15%～20%的日本人曾罹患AC，我国目前缺乏AC 的大样本流行病学数据，但又研究显示有10%以上的人罹患此病［5］。在AC 分型方面，我国以SAC、PAC 和VKC 尤为常见，其中SAC 和PAC 占所有AC 患者的74%［5，7］。

图1 不同类型过敏性结膜炎患儿治疗前后泪液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平变化Figure 1 Changes of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of children with different types of allergic conjunctivitis before and after treatment

胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）是近些年才被逐渐认识的免疫活性细胞因子，主要由肺、皮肤上皮细胞，成纤维细胞，肥大细胞等多种类型细胞分泌产生［8］。TSLP 功能与IL-17 类似，在免疫细胞的增殖、分化、成熟、活化等过程中发挥重要作用，尤其是对树突状细胞（DC）的成熟、活化发挥调控功能［9］。活化的DC 介导CD4+naive T 细胞向Th2细胞转化，分泌过敏性细胞因子IL-4、IL-5 和TNF-α，下调IL-10 和IFN-γ 的合成，这些细胞因子共同促进IgE 合成和嗜酸性粒细胞的增殖来启动过敏性反应［10-11］。嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）是嗜酸性粒细胞的标志性蛋白分子，ECP 的表达水平可反映嗜酸性粒细胞活化情况，ECP 可介导肥大细胞释放介质，介导过敏性疾病的发生，在过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性咳嗽中均有报道［4，12］。人转化生长因子β1（TGF-β1）主要是由具有负调控功能的免疫细胞Treg 细胞合成分泌的一种细胞因子，其主要功能是发挥免疫抑制功能［13］。TGF-β1 可促进Treg 细胞的活化增殖，诱导CD4+CD25-naive T 细胞向CD4+CD25+调节性T 细胞（Treg）转化，TGF-β1 也是维持Treg 细胞免疫抑制功能的关键因子［14］。

liquichip 液相芯片技术是综合激光技术、荧光微球技术、流式细胞术、免疫化学技术和数字信号处理技术而成的新型蛋白分子检测技术［15］。结果提示在AC 发病过程中Treg 细胞的功能受到抑制，TSLP 和ECP 的表达与疾病严重程度正相关。因此，上述细胞因子有作为AC 辅助诊断标志物的潜力，但需要更大样本和更深入机制研究的支持。

综上所述，通过TSLP、TGF-β1 和ECP 与过敏性结膜炎及其严重程度，病情进展康复之间的相关性，为深入了解TSLP、TGF-β1 和ECP 在过敏性结膜炎发病中的具体机制提供新思路，也表明了TSLP、TGF-β1 和ECP 成为过敏性结膜炎新型辅助诊断标志物的潜力。