白酒固态酿造中酵母种群结构和生态环境多样性变化规律的研究进展

任妍菱 林 巧 赵树东 杨柳炜 张婷婷 余 鑫

（西昌学院，四川西昌 615000）

目前，关于白酒发酵过程中酵母种类和酵母总数变化的报道中，酵母生态分布的变化和整个酿造过程中的种群结构尚不十分清楚。研究仍处于起步阶段，白酒酿造是一种自然的多细菌固态发酵过程，酵母种群的挖掘有助于白酒固态发酵微生物的研究，对白酒质量、安全的提升具有重要意义；研究酿造环境中微生物组成结构有助于解析完全微生物的真实物种信息。同时，也能具体了解影响白酒发酵的环境微生物，为进一步分析酵母功能和选择适合白酒酿造的优良酵母菌种奠定了基础。

1 酵母种群结构

酵母是白酒生产过程中的主要功能微生物，如在淀粉糖化、酒精生成、芳香物质形成、糟醅发酵、成品质量等方面都起到重要作用。

罗方雯等研究结果表明，在酱香型白酒酿造过程中分离出的酵母包括复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、红酵母属（Rhodotorula）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、柯达酵母属（Kodamaea）、拜耳结合酵母属（Zygosaccharomyces）、南极假丝酵母属（Pseudozyma sp）各1 种，隐球菌属（Cryptococcus）、德巴利酵母属（Torulaspora）、酿酒酵母属（Saccharomyces）、伊萨酵母属（Issatchenkia）各2 种，丝孢酵母属（Trichosporon）3 种，维克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）4 种，毕赤酵母属（Pichia/Hyphopichia）6 种，假丝酵母属等，得出酿造环境的特征性优势酵母为W.anomalus、S.cerevisiae 和H.burtonii；酱香型大曲的特征性优势酵母为W.anomalus 和S.fibuliquras，明确了酱香型大曲的优势酵母菌结构。

李增胜等在研究清香型白酒的发酵过程中发现酒中的酵母主要是酿酒酵母属，具有最强的酒精生产能力；其次是具有较弱酒精生产能力的汉逊酵母、假丝酵母菌和拟内孢霉；此外还有少量的毕赤酵母和产膜酵母。其中，酿酒酵母、汉逊酵母和内生孢子拟内孢霉均为无孢菌属，酿酒酵母和内生菌属；假丝酵母是链球菌科的一种，属于半已知真菌。

崔小亮等研究结果表明，在浓香型白酒的生产过程中可以分离培养的酵母类型包括酿酒酵母、库氏毕赤酵母、海洋嗜杀酵母、扣囊复膜酵母菌、拜氏接合酵母、半乳糖酵母、洛伦隐球菌。功能性酵母筛选结果表明，S.fibuligera WY 5-1 和S.cerevisiae WY 3-2 具有良好的乙醇生产特性。巴斯德毕赤氏酵母WY 6-3 和WY 9-2 具有良好的酯生产特性，温度和pH 的耐受性为浓香型白酒在工业生产中选择菌株提供了更多可能性。

2 酵母种群主要研究方法

2.1 传统分离培养法

传统分离培养法中最常见的是微生物平板培养法。该方法是利用营养成分不同的固体培养基分离培养可培养的微生物，并根据菌落的数量和形态确定微生物的数量和类型。分离和培养微生物的平板稀释法是最普遍的操作之一，通常分为稀释、接种、培养、计数几个阶段。但该方法存在许多不足，比如在选择固体培养基和实验室培养条件上都存在一定的局限性。

2.2 分子生物学技术

2.2.1 真菌内转录间隔区研究技术

在研究微生物环境和生态学方面，微生物群落的多样性是研究重点。目前，宏基因组学在微生物多样性研究中的应用已经引起了更多科研人员的关注。然而，对于同样的样本，宏基因组学研究通常占细菌种群的大部分，而真菌和其他微生物种类则远远落后。这对某些研究区域具有局限性，例如在酿酒过程中对微生物种群每个时期的探讨。细菌的作用远远低于真菌，对酒的质量影响更大。因此，利用真菌独特的内转录间隔区序列作为目标序列是富集复杂样品中真菌DNA 的有利措施。

复合标签技术及其在多样本真菌高通量测序中的应用，可以提高样本流速，有效降低高通量测序的成本，有效丰富样本中的真菌种群。真菌种群为研究真菌多样性提供了一种高通量的分析方法。

2.2.2 PCR-DGGE 技术

在分子生物学上，PCR-DGGE 技术是运用率最高的分析方法之一，作为研究环境微生物群落结构的重要手段，已被广泛用于海洋和土壤微生物的研究当中。该技术准确度高、效能高、操作简单，能清晰地说明样本中微生物的多样性，对微生物动态群落变化进行更加深入的了解。DGGE 方法使用聚丙烯酰胺中形成变性梯度和特异性引物，经PCR 扩增后得到长度一样的靶片段。进行电泳时，GC 含量较低，变性后，以不同的迁移速率分离出不同GC 含量的核酸。

PCR-DGGE 技术的原理是从环境样本中提取出DNA，通过PCR 的扩增获得更多相同长度、不同序列的基因片段。DNA 中4 个碱基排列方式和组成的差异会导致序列不一样的双链DNA 分子融化时冷热程度有所差异，然后通过梯度凝胶电泳变性时构成不同的条带，并且与DGGE 指纹图谱进行比较，可以得到微生物的群落结构的总体资料。

2.2.3 高通量测序技术

高通量测序技术是可以进行深刻而透彻测序的下一代测序方法，可以同时分析几十万到几百万个DNA 分子的序列，通常是非常短的长度，允许对一个物种的转录组和基因组进行精确深入的研究。当前这种测序技术设计出了第二代和单分子测序技术，主要是Roche 454 的GSFLX 平台，ABI 的SOLID 测序平台和Illumina 的SolexaGenomeAria。1yzer 测序平台。第二代测序技术具有高通量、重复性好、精确度高、无需构建文库、无克隆错误、最大限度地节省人力和物力等优点。其中，Roche 454的原理是依靠酶级联生物发光反应进行DNA 序列分析。DNA 聚合酶、三磷酸腺苷、荧光素酶和二磷酸酶共同作用，聚合每个引物的dNTP 并发出荧光信号。对荧光信号的存在情况以及强度大小的检测，DNA 序列可以得到确定。Solexa 测序原理是桥式PCR，合成测序和可逆终结者。dNTP 与荧光标记的dNTP 通过酶催化串联反应直接连接，在合成或连接过程中形成互补链。将捕获的光信号转换成序列峰，得到互补的链序列信息。Abi-solid 测序的原理是根据大规模的磁珠平行克隆和DNA 连接的测序，通过连接酶检测寡核苷酸上的荧光团。

3 环境对酵母的影响

环境的改变会导致酒醅中初始微生物结构的差异，进而导致微生物种群演替差异，其中酵母的种群结构也会受到影响。

3.1 高温环境

对于酵母耐热机制的研究，早期主要集中在比较生物学上。酵母质膜的流动性在高温下会受到影响。当温度太高时会造成膜紊乱以及造成蛋白质的变性，抑制糖酵解并增加突变。同时，质膜的渗透性得到增加，从而质子流增加。高温对酵母细胞也有。温度越高，越容易引起酵母过早衰老和死亡，从而使细菌占主导地位。温度通常会导致酵母细胞中各种成分的变化，例如脂肪酸、磷脂、麦角固醇等。

3.2 低温环境

在温度较低时酵母具有更高的糖吸收能力，缓慢的糖酵解作用，使海藻糖、糖原和其他储备糖的合成增加，HOG-MAPK 途径被激活，甘油产量增加。温度过低时会导致酵母对氮喜好程度的改变，使NCR 系统的效率下降，并影响可渗透酶的活性和氮的吸收。降解代谢途径在低温发酵中期和后期涉及到氨基酸代谢的基因表达会增强。低温主要通过减少链长和增加中链脂肪酸来改善膜的流动性，从而影响酵母细胞膜的脂肪酸组成。低温对氮代谢、酵母糖代谢和脂质代谢的影响可以更好地改善酒的感官品质。

3.3 耐酸环境

酯的生产能力是判断酵母性能的重要指标，特别是在低pH 值的环境中，具有优异性能的细菌可以发挥其优势。随着醋酸发酵，醋醅酸度和温度持续上升，酒精含量不断下降。酸度阻碍酵母的生长和发酵。

3.4 无机盐和矿物质对酵母的影响

在生长过程中，微生物需要无机盐来保持细胞的渗透压，各种矿物质元素，如钙、铁、锌、锰等对酶的功能和酶活性也有重要影响。华艳艳等研究表明，向种子培养基中加入锰可以改变细胞的形态，可以提高红发夫酵母中D-葡萄糖苷酶的活性；向发酵培养基中添加0.1 g/L Mn2+可显著促进细胞生长和虾青素合成。吴泽柱等试验结果表明，优化培养基中的营养成分可以有效提高酵母的发酵能力。边芙蓉等研究表明，添加一定量金属离子对增加谷胱甘肽产量有很好的作用。

3.5 培养基中各营养组分对酵母发酵的影响

邢建宇等研究表明，蛋白胨和酵母膏显着提高了酿酒酵母细胞密度、乙醇耐受性和发酵能力，其中酵母提取物的作用更大。最终，在培养时通过乙醇冲击试验，得出酵母提取物含量高的培养基能够有效复原酵母对乙醇冲击的生长和繁殖能力，有效适应高浓度酒精环境。

4 不同酵母之间的相互作用

4.1 酿酒酵母和异常汉逊酵母两者之间的相互作用

颜兵等通过研究证明酿酒酵母发酵产生的代谢产物抑制了异常汉逊酵母的生长发育。通过试验发现，在与酿酒酵母混合培养期间，异常汉逊酵母被显著抑制。通过对营养液、酒精、pH 等因素的研究，得出在无细胞滤液中，异常汉逊酵母的生长发育被显著抑制，但是酿酒酵母的生长一切正常，这说明异常汉逊酵母的生长和发育会受到酿酒酵母代谢产物的抑制作用，而不受其他因素的影响。

4.2 酿酒酵母和地衣芽孢杆菌二者作用

凌杰等研究结果表明，酿酒酵母对地衣芽孢杆菌的生长存在一定的抑制性，而高温会削弱酿酒酵母的抑制作用。原因如下：首先，地衣芽孢杆菌的生长会受到酿酒酵母产生的一些大分子蛋白质的影响。其次，因为酿酒酵母在生长发育过程中会产生酸，从而降低了环境的pH 值，对地衣芽孢杆菌的生长有一定抑制。当没有酵母细胞在环境中存活时，地衣芽孢杆菌会让这种抑制作用逐渐减弱并趋于正常生长状态。这一发现在有效控制白酒的产量和质量方面起着重要作用。

4.3 乳酸菌与酵母菌之间的作用

熊君燕等研究结果表明，以还原糖消耗率作为酵母菌产乙醇和乳酸菌产有机酸的主要指标，在乳酸菌和酵母菌的共培养条件下，乳酸菌对3 种酵母菌生长有不同程度的抑制，对S.Cerevisiae YJ1 产乙醇抑制作用最大，对C.aaseriMJ7 和P.kudriavzeviiMJ14 产乙醇影响很小。对乳酸菌而言，P.KiavzeviiMJ14 对乳酸菌具有抑制作用，而对P.sp.JYA1 和L.Plantarum JMRS4 产乙酸起促进作用。就代谢产物而言，L.1actisJMRS1-2 和L.plantarum JMRS4 分别是产乙酸和乳酸的主要菌株。

4.4 酿酒酵母和毕赤酵母之间的作用

陈景桦等研究成果表明，在混合发酵过程中，酿酒酵母和毕赤酵母的酯酶活性得到适当提高。当白酒中酯类的含量增加时，白酒的香气会增强。当巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母在混合酒精发酵过程中，琥珀酸、乙酸、甘油和挥发性酸的产生与酵母细胞的生长呈正相关。当酒精发酵过程中的酵母数达到平衡阶段时（6 d～10 d），混合发酵过程中产生的甘油、琥珀酸、乙酸和挥发酸含量最高。与酿酒酵母相比，混合发酵过程中的乳酸和琥珀酸含量基本保持不变，挥发酸含量呈下降趋势，但甘油含量明显增加，这表明酿酒酵母和发酵毕赤酵母混合发酵对酒的酸度没有显著影响，但混合过程中提高酒的质量可以通过增加甘油含量来实现。

5 酵母菌演替规律

杨建刚等研究，得出的结论是，第0 天，酒窖中的主要酵母类型为C.rugopelliculosa、S.termentans、N.castellii、T.delbrueckii 和S.cerevisiae；在第4 天，酒窖中的酵母数量非常丰富，其中占优势的酵母为T.delbrueckii，N.castellii，S.cerevisiae 和P.membranifaciens。在第8 天，酵母数量增多，但是酵母的种类逐渐减少。酵母的主要类型是酿酒酵母，而C.humilis 和K.exigua 是主要的酵母。经过12 d 的试验，发现随着酒窖环境的变化，酵母菌的数量和类型同时减少。在此阶段，酒窖中的酵母主要是卡氏酵母和酿酒酵母。到20 d～30 d，随着酒窖pH 值的降低和乙醇含量的增加，酿酒酵母已成为酒窖中的主要菌株。在第44 d，发酵已经结束，但酒窖中的酵母数量很少，酵母种类趋于多样化。

6 结论

目前，白酒的生产仍采用传统发酵工艺，这种生产方法具有很强的不确定性和经验性，不能准确地控制白酒的生产。如何在传统生产工艺的基础上建立稳定的生产安全保证体系，并且要维持“手工创造的高贵品质”，建立完整稳定的质量安全体系，是目前所有白酒生产企业面临的困难和机遇。因此，研究固态发酵白酒中酵母菌种群结构和多样性的变化规律，利用酵母菌种群的优势对提高白酒的质量和品质，提高低浓度白酒的稳定性以及确定白酒酒龄等具有重要意义。