吡菲尼酮对UUO大鼠肾纤维化组织中TGF-β1/smad3通路表达的影响①

康晓明,杨舒贺,聂 晶,孟庆云,杨 松,杨占双(佳木斯大学附属第一医院儿内一科， 黑龙江 佳木斯 154003)

肾脏纤维化是慢性肾脏疾病终末期过程,其改变包括炎性细胞浸润，成纤维细胞活化，管周毛细血管损失和肾小管萎缩[1]。Yuan[2]等证明，肾近端小管上皮细胞的线粒体代谢功能障碍参与了上皮 - 间质转化(EMT)的发病机制。线粒体功能的异常激活凋亡程序是纤维化的重要细胞因子条件。Corcoran[3]等人证明线粒体在肾上皮细胞中具有扩增TGF-β1诱导纤维化，表明线粒体通过调节TGF-β1信号转导促进纤维化的进展。目前，纤维化的具体作用机制及相关通路的探索仍缺乏全面认识及更详尽的叙述，故本课题意在探讨该通路的因子调节程序，为研发抗肾间质纤维化的药物、慢性肾脏疾病的控制及治疗具有重要临床应用意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

雄性Wistar大鼠体重(150±10)g；吡菲尼酮片，兔抗大鼠TGF-β1、smad3多克隆抗体、DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 实验步骤

72只Wistar雄性大鼠体重随机均分为3组,行单侧输尿管结扎制成UUO模型，分为假手术组、模型组、吡菲尼酮(500mg/kg·d灌胃),模型组和对照组以等量生理盐水灌胃；各组大鼠灌胃每日一次。各组大鼠分别在手术后第3, 7, 14天分批处死。处死前留取静脉血，留取左侧梗阻肾标本，梗阻肾沿矢状面用手术剪小心剖开，肾组织在4%多聚甲醛中固定24h，常规脱水石蜡包埋，待做HE染色、Masson染色及免疫组织化学等。

1.2.2 生化指标检测

各组大鼠静脉血行血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)生化检测。

1.2.3 HE

各组肾组织经切片染色后光镜下选取10个200倍不同视野，用TLS评分表示损伤程度[4]。

1.2.4 免疫组化

观察TGF-β1、smad3表达状况，视野内表现为棕黄色的颗粒为染色阳性指标。随机观察10个不同视野，利用图像分析系统分析两组阳性染色(棕黄色颗粒)的平均光密度，用AOD表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 生化分析

Sham 组鼠血BUN、Scr等生化指标无明显差异(P>0.05)。UUO模型组大鼠生化指标较sham 组明显升高，治疗组大鼠指标较UUO组各指标降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组生化指标变化

2.2 HE 染色

光镜下可见Sham组大鼠在第3、7、14d肾脏结构无明显改变。UUO模型组大鼠随着时间的增加，肾小管扩张，间质可见炎性细胞浸润，基底膜细胞被大量破坏。治疗组基底膜细胞破坏程度及炎性物质浸润程度均较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠不同时间点TIS评分比较分)

2.3 免疫组化

Sham 组TGF-β1及smad3表达较少；UU0组随梗阻时间的延长表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05);与UUO组相比，治疗组 棕色颗粒表达减少，差异有统计学意义(P<0.05) 。见表3。

表3 3组大鼠TGF-β1、Smad 3在肾小管表达情况

3 讨论

吡菲尼酮(5-甲基-1-苯基-2(1H) - 吡啶酮)已被临床用于治疗各种纤维化疾病[5]。Takakuta[6]等发现它可抑制TGF-β诱导的纤维连接蛋白的表达。 通过干预体外实验中大鼠肾脏成纤维细胞，减弱活化和有丝分裂，导致纤维连接蛋白明显减少。可保留受损肾脏细胞中线粒体嵴结构，减少了肿胀线粒体的出现，起到保护肾脏功能的作用，并且其对线粒体的调节机制是通过诱导TGF-β/smads通路实现的[7]。在肝纤维化动物模型中，还可降低TGF-β1 mR N A表达，胶原特异性分子被认为在细胞外基质合成和重塑中起重要作用。在肾脏研究中，吡菲尼酮已被证明可通过降低纤溶酶原激活物抑制剂-1表达，诱导TGF-β1对于基质的降解作用与本实验观察结果一致。在小鼠系膜细胞中，吡菲尼酮降低TGF-β1启动子活性，降低蛋白分泌，并调节下游Smad通路磷酸化[8]，与本实验研究结果一致。

TGF-β1可通过激活Smad依赖性和非依赖性途径诱导肌成纤维细胞分化来增强成纤维细胞的增殖，迁移和胶原产生能力，导致纤维化的出现。Monique[9]等实验证实吡菲尼酮治疗减弱TGF-β1诱导的Smad2 / 3的磷酸化，与本实验研究发现治疗组大鼠较UUO组相比TGF-β1及smad3表达较对应时间点减少，结果一致。

结合本实验结果，证实了TGF-β1/smad3通路在肾间质纤维化进展过程中起到重要的作用。其可通过抑制线粒体形态及功能，进而影响上皮-间质转分化进程及降解细胞外基质等多种途径影响纤维化。吡菲尼酮可抑制肾小管内TGF-β1/smad3通路的表达从而延缓肾纤维化的进程。